[發明專利]一種AsCpf1突變體蛋白、編碼基因、重組表達載體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710586386.2
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107312761B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 江蘇溥博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/70;C07K14/705;G01N33/68
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 周敏

本發明公開了一種AsCpf1突變體蛋白、編碼基因、重組表達載體及其制備方法與應用。該AsCpf1突變體蛋白為序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；其編碼基因是序列2所示的DNA分子；含有所述編碼基因的重組表達載體是以序列2所示的AsCpf1(S589Q/P711T)為模板設計引物進行PCR擴增，再將純化的PCR產物用無縫克隆方法插入pET15b載體的多克隆位點NcoI和XhoI之間得到；本發明的AsCpf1突變體蛋白及其編碼基因、重組表達載體可用于基因編輯原代T細胞PD?1。利用本發明的AsCpf1突變體蛋白能夠實現原代T細胞PD?1的敲降，為基因編輯T細胞PD?1基因及癌癥免疫治療打下基礎。

技術領域

本發明屬于生物化學與分子生物學技術領域，具體涉及一種AsCpf1突變體蛋白、編碼基因、重組表達載體及其制備方法與應用。

背景技術

基因編輯是在基因組水平上進行精確修飾的一種技術，可完成基因定點刪除突變、基因定點插入突變、多位點同時突變和小片段的刪失等。基因編輯技術可用于基因功能及疾病發病機理研究、構建疾病動物模型、生物治療、遺傳和腫瘤相關疾病研究、整合病毒疾病研究和改良農畜牧物種。CRISPR-Cas9是繼“鋅指核酸內切酶(ZFN)”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)”之后出現的第三代基因組定點編輯技術。

AsCpf1(Acidaminococcμs sp.Cpf1)是一種RNA介導的V型CRISPR-Cas9系統內切酶，在單鏈crRNA(CRISPR RNA)存在的情況下，AsCpf1識別雙鏈DNA的5’-TTTN-3’PAM(protospacer adjacent motif)，并在雙鏈DNA的與crRNA互補鏈的第18個堿基和非互補鏈的第23個堿基處對DNA進行切割。與CRISPR-Cas9基因編輯系統相比，CRISPR-AsCpf1系統具有不需要tracrRNA(trans-activating crRNA)、切割靶向DNA效率高、切割產生粘性末端等特點，是潛在的、可用于真核生物基因組編輯的工具。

PD-1(programmed death 1)，程序性死亡受體，是一種重要的免疫抑制分子，為CD28超家族成員，最初是從凋亡的小鼠T細胞雜交瘤2B4.11克隆出來。作為癌癥免疫治療的重要靶點，以基因編輯T細胞的PD-1基因為靶點的免疫調節對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意義。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種AsCpf1突變體蛋白，可用于編輯T細胞的PD-1基因。

為實現上述目的，本發明提供的AsCpf1突變體蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明的目的之二是提供一種重組AsCpf1基因突變體，對AsCpf1基因進行結構改造，可用于編碼上述AsCpf1突變體蛋白。

為實現上述目的，本發明提供的一種重組AsCpf1基因突變體AsCpf1(S589Q/P711T)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。AsCpf1(S589Q/P711T)是對AsCpf1基因進行密碼子優化，并將野生型AsCpf1中的兩個氨基酸位點(S598Q和P711T)突變得到。

本發明的目的之三是提供一種含重組AsCpf1基因突變體的重組表達載體。

為實現上述目的，本發明提供的重組表達載體pET15b-AsCpf1(S589Q/P711T)，是以SEQ ID NO：2所示的AsCpf1(S589Q/P711T)為模板設計引物進行PCR擴增，再將純化的PCR產物用無縫克隆方法插入pET15b載體的多克隆位點NcoI和XhoI之間得到。

本發明的目的之四是提供AsCpf1突變體蛋白的制備方法，得到高純度的AsCpf1突變體蛋白。

為實現上述目的，本發明提供的AsCpf1突變體蛋白的制備方法，包括如下步驟：