[發明專利]巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記及其應用和檢測方法

有效

• 申請號: 201710585867.1
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107267632B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發明（設計）人: 冉春;于士將;羅忍;潘琦;王翠倫;侯棟元;叢林;劉浩強;李鴻筠
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

本發明公開了一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，及擴增該標記的引物4F/4R；還公開了分子標記在巴氏新小綏螨對阿維菌素敏感品系和抗性品系分類中的應用；還公開了巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記的檢測方法：先提取待測巴氏新小綏螨的總DNA，以總DNA為模板用引物4F/4R進行PCR擴增，得到包含突變區域的NbGluCl基因片段，將得到的基因片段與SEQ ID No.3所示的巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記進行序列比對，即可判斷該品系是對阿維菌素的敏感品系或抗性品系。該標記的特異性強、穩定性高，可分析出待測樣本是對阿維菌素的敏感品系還是抗性品系。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種分子標記，尤其涉及一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記及其應用和檢測方法。

背景技術

巴氏新小綏螨屬蜱螨亞綱，寄螨目，革螨亞目、植綏螨科，小新綏螨屬，因其發育歷期短、死亡率低、產卵率高、擴散力強的優點被認為是最好的生物防治天敵之一。巴氏新小綏螨是多食性捕食螨，除了捕食葉螨和薊馬外，還可以捕食蚜蟲、木虱、粉虱、介殼蟲、跳蟲、跗線螨、絲狀菌和蚊蠅類的幼蟲等。

阿維菌素是一種新型生物殺蟲殺螨劑，是目前使用較為廣泛的農藥制劑，在柑橘果園中主要用于防治柑橘全爪螨。本實驗室研究表明，阿維菌素同樣對巴氏新小綏螨具有較強的毒力，室內生物測定LC₅₀值為50.03mg/L,因此在施藥過程中很容易造成巴氏新小綏螨大量死亡，化學防治與生物防治無法協調開展。

通過室內篩選獲得抗藥性巴氏新小綏螨，釋放到果園后，捕食螨可以有效應對農藥脅迫，這對于巴氏新小綏螨的田間種群建立與害螨的綜合防控具有很高的實用價值。目前螨類對阿維菌素的抗性產生普遍認為是由于其靶標谷氨酸門控氯離子通道基因(NbGluCl)發生基因突變而導致的。

發明內容

本發明根據巴氏新小綏螨對阿維菌素敏感和抗性品系分類領域的空白，提供一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記。

本發明的另一目的是提供該分子標記在巴氏新小綏螨對阿維菌素敏感品系和抗性品系分類中的應用。

本發明解決其技術問題采用的技術方案：一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本發明還提供了一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記的特異性正反向引物，所述引物序列如下：

4F：5’-AAACGAAACGGGCTACTGT-3’；

4R：5’-CTTCTGCGTGGACTCGTTA-3’。

本發明還提供了一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記的檢測方法：先提取單頭待測巴氏新小綏螨的總DNA，以總DNA為模板用權利要求3中的特異性正反向引物進行PCR擴增，得到包含突變區域的NbGluCl基因片段，將得到的基因片段與權利要求1中的巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標記進行序列比對，即可判斷該品系是對阿維菌素的敏感品系還是抗性品系。

所述PCR體系為：PCR Master Mix 25μL，正反向引物各2μL，待測樣本DNA模板50～100ng，補充ddH₂O至50μL。

所述PCR擴增的程序為：94℃預變性3min；然后94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸5min。

本發明的有益效果是：