[發(fā)明專利]細(xì)胞工廠制備麻疹病毒原液及麻疹系列減毒活疫苗制劑

在審

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• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107418936A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付永其;宋艷梅;楊云凱;高靜;張穎欣;劉輝;孫雅;申亞楠;律苗
• 申請（專利權(quán)）人: 北京北生研生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A61K39/165;A61K39/20;A61K39/295;A61P31/14
• 代理公司: 北京三友知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11127
• 代理人: 韓蕾,姚亮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒疫苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞工廠制備麻疹病毒原液及麻疹系列減毒活疫苗制劑。

背景技術(shù)

麻疹是由麻疹病毒引起，經(jīng)呼吸道傳播的急性傳染病，易感人群涵蓋了所有無特異性免疫力及免疫力低下的兒童及成人。麻疹發(fā)病率及病死率在疫苗使用前位居兒童傳染病之首。目前，疫苗接種仍舊是預(yù)防麻疹感染和控制其流行的最有效措施。

現(xiàn)階段，國內(nèi)外麻疹病毒的培養(yǎng)多使用原代雞胚細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)，轉(zhuǎn)瓶技術(shù)為傳統(tǒng)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器——轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)成熟，放大只需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點(diǎn)。但也有其缺點(diǎn)：

(1)自動化程度低，人工操作工作量大，雖然有轉(zhuǎn)瓶機(jī)輔助，但各個工序操作環(huán)節(jié)中仍需要大量的手工操作，不能實(shí)現(xiàn)自動化和標(biāo)準(zhǔn)化；

(2)大量的清洗驗(yàn)證工作，清洗質(zhì)量受人為因素的影響、難以保證清洗效果的一致性，人工和清洗驗(yàn)證成本逐年增加；

(3)占用空間大產(chǎn)，在現(xiàn)有的條件下，轉(zhuǎn)瓶本身的局限性難以產(chǎn)業(yè)化或規(guī)模化生產(chǎn)；

(4)人工操作較繁瑣，玻璃易碎，增加人員感染風(fēng)險(xiǎn)及操作環(huán)境的污染風(fēng)險(xiǎn)顯著增加；

(5)生產(chǎn)工藝可控性差，瓶間差異較大，難以保證制品質(zhì)量的細(xì)胞批間一致性，且細(xì)胞生長成單層成纖維細(xì)胞的時(shí)間較長，需要72-96h；

(6)病毒收獲為單次收獲，不能完整有效的利用細(xì)胞，影響產(chǎn)能的放大。

采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)2-3次收獲病毒原液，但每次收獲的單次病毒原液僅為2000-3000mL，且瓶間病毒滴度差異較大，多次打開瓶口也會造成污染的風(fēng)險(xiǎn)升高。

目前，應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)亦稱為國內(nèi)外各個生產(chǎn)研究機(jī)構(gòu)的關(guān)注重點(diǎn)，Vero細(xì)胞、人二倍體細(xì)胞應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)已獲得成功。但雞胚、地鼠腎等原代細(xì)胞采用生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)還未有成功的報(bào)道。理論上講，原代細(xì)胞培養(yǎng)利用生物反應(yīng)器是可行的，但需進(jìn)行長期的工藝摸索。

因此，獲得高滴度麻疹病毒原液，配制多聯(lián)多價(jià)的含麻疹病毒的系列疫苗，提高產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，擴(kuò)大麻疹系列疫苗產(chǎn)品的產(chǎn)能，降低污染的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步復(fù)合日益升級的GMP管理的要求，充分滿足國家免疫規(guī)劃的要求是目前亟待解決的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用細(xì)胞工廠制備麻疹病毒原液及麻疹系列減毒活疫苗制劑，從而實(shí)現(xiàn)在同等生產(chǎn)規(guī)模下，減少細(xì)胞消化批數(shù)，并獲得高滴度的麻疹病毒液，有效提高麻疹系列疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，擴(kuò)大制品的產(chǎn)能。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)；

本發(fā)明提供一種利用細(xì)胞工廠制備麻疹病毒原液的方法，其包括以下步驟：

選用SPF雞胚細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞懸浮液加入到細(xì)胞工廠中；

將麻疹病毒的工作種子與細(xì)胞懸浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接種于細(xì)胞工廠中，于33±1℃的溫度下靜置培養(yǎng)3-4天，傾去原細(xì)胞培養(yǎng)液，換以新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)5％-10％的病變時(shí)，傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，用不少于原細(xì)胞培養(yǎng)液量的洗液洗滌細(xì)胞表面，并換以病毒維持液繼續(xù)培養(yǎng)；

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)50％-75％的病變時(shí)，收獲單次麻疹病毒液。

單次麻疹病毒液即為單批次生產(chǎn)的麻疹病毒原液，將同一細(xì)胞批生產(chǎn)收獲的單次麻疹病毒液澄清過濾并檢測合格后進(jìn)行合并。

上述利用細(xì)胞工廠制備麻疹病毒原液的方法中，優(yōu)選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)液為滅能小牛血清的0.2％乳蛋白的Earle’s液。

上述利用細(xì)胞工廠制備麻疹病毒原液的方法中，優(yōu)選地，所述細(xì)胞懸浮液制備方法為：

選用9-11日齡來自SPF雞群的雞蛋，經(jīng)消毒后取出雞胚，去除雞胚頭部及內(nèi)臟，剪碎；用0.125％的胰蛋白酶于37±1℃溫度下對剪碎的雞胚水浴消化18-22min，然后加入0.2％的乳蛋白Earle’s液進(jìn)行分散處理，最后加入含滅能小牛血清的0.2％的乳蛋白Earle’s液作為細(xì)胞培養(yǎng)液，得到細(xì)胞懸浮液。

上述利用細(xì)胞工廠制備麻疹病毒原液的方法中，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)50％-75％的病變時(shí)，收獲單次麻疹病毒液的具體操作為：

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)50％病變時(shí)，進(jìn)行第一次收獲麻疹病毒液，收獲后再加入新鮮的病毒維持液繼續(xù)培養(yǎng)；