[發明專利]用于檢測孢子絲菌病的血清凝集劑的制備方法

有效

• 申請號: 201710584396.2
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107478820B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 田晶晶;尹煥才
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 韓飛

本案涉及一種用于檢測孢子絲菌病的血清凝集劑的制備方法，包括：取出培養的孢子絲菌酵母相，離心去上清；加入?20℃預冷的預固化液，混勻，置于4℃中反應0.5?2小時；在4℃下離心，去上清，加入2?4％多聚甲醛，混勻后在4℃下固定保存過夜；加入0.1?0.5％ TritonX?100、0.5?1％ BSA、5?10％的蛋白保護劑和0.02?0.05％的ProClin300，混勻；加入染色劑，反應10?20min后，離心去上清，以PBS緩沖液稀釋得血清凝集劑；預固化液中包括有乙二醇和甘油磷酸酯。本案無需儀器、成本低、快速、操作簡便、結果直觀，尤其適合基層醫療機構的檢測應用，具有廣泛的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物試劑制備領域，特別涉及一種用于檢測孢子絲菌病的血清凝集劑的制備方法。

背景技術

孢子絲菌病是由孢子絲菌復合體中的一種真菌感染所致慢性化膿性肉芽腫性的疾病，可以引起皮膚、皮下組織及附近淋巴系統的亞急性或慢性感染,另外也可引起黏膜、骨骼甚或系統性病變。

孢子絲菌復合體包括：申克氏孢子絲菌，白色孢子絲菌、巴西孢子絲菌、球形孢子絲菌、盧里孢子絲菌和墨西哥孢子絲菌。

孢子絲菌為雙相型真菌，在24℃為菌絲相，在37℃培養或者在感染的人體組織時為酵母相。當孢子絲菌侵入人體組織時，孢子絲菌細胞壁成分作為粘附素和免疫誘導劑，會誘導刺激機體產生抗體。有文獻表明，孢子絲菌酵母細胞的細胞壁上有一個大約70KDa糖蛋白(gp70)，有規律地沿著真菌細胞壁分布，介導粘附到細胞外，這是孢子絲菌特有的，在其它的致病性和非致病性真菌尚未被檢測到，因此可利用此蛋白(gp70)作為抗原標志物，通過檢測血清中gp70的抗體，進而鑒定孢子絲菌病。目前臨床診斷方式：結合臨床表現、真菌培養和組織病理檢查可明確診斷。其中，真菌培養是孢子絲菌病診斷的金標準。但是這兩種方法存在耗時長、操作繁瑣、技術要求高等缺點，不利于快速診斷篩查，不適合在基層醫療機構的檢測應用。

凝集反應是一種基于免疫學的反應，過程為顆粒性抗原(完整的病原微生物或細胞等)與相應抗體結合，在有電解質存在的條件下，經過一定時間，出現肉眼可見的凝集小塊，可進行結果判讀。但是直接凝集反應中的顆粒型抗原，常規使用的是新鮮細胞或者細菌，不宜長期保存，以及操作繁瑣等缺陷。

發明內容

針對現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種用于檢測孢子絲菌病的血清凝集劑的制備方法，該血清凝集劑基于凝集反應原理，利用固定化處理的完整的孢子絲菌作為顆粒性抗原(該顆粒性抗原同時具備顏色指示作用)，可與待檢樣品(血清、血漿)中的孢子絲菌特異抗原標志物的抗體結合，發生凝集反應，根據是否發生凝集反應可以判定待檢樣品中是否存在孢子絲菌抗體，從而進一步可初步判斷患者是否被孢子絲菌感染。

為實現上述目的，本發明的技術方案概述如下：

一種用于檢測孢子絲菌病的血清凝集劑的制備方法，其包括：

1)培養孢子絲菌酵母相；

2)取出培養的孢子絲菌酵母相，用PBS緩沖液離心洗滌，去除上清；

3)向洗滌后的孢子絲菌酵母相中加入-20℃預冷的預固化液，混勻，置于4℃中反應0.5-2小時；隨后在4℃下離心，去除上清，加入2-4％多聚甲醛，震蕩混勻后，在4℃下固定保存過夜；

4)加入0.1-0.5％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5-1％BSA(牛血清白蛋白)、5-10％的蛋白保護劑和0.02-0.05％的ProClin300，混勻；

5)加入染色劑，反應10-20min后，離心去上清，以PBS緩沖液稀釋，獲得血清凝集劑；

其中，所述預固化液中至少包括有乙二醇和甘油磷酸酯。

優選的是，所述的用于檢測孢子絲菌病的血清凝集劑的制備方法，其中，所述預固化液中還包括有乙醇。