[發(fā)明專利]一種定量測定血清中甘膽酸的檢測方法

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• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107247044A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發(fā)明（設計）人: 趙肅清;沈定;陳瑩珊;何綺怡;梁文星
• 申請（專利權）人: 廣東工業(yè)大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發(fā)明涉及檢測分析技術領域，特別涉及一種定量測定血清中甘膽酸的檢測方法。

背景技術

甘膽酸(cholyglycine，簡稱CG)，別名N-(3,7,12-三羥基-24-羰基膽烷-24-基)-甘氨酸，是膽酸與甘氨酸結合而成的結合型膽酸之一。甘膽酸是由肝細胞合成，同膽汁進入腸道，經門靜脈再回到肝臟；當肝細胞受損時，肝細胞攝取甘膽酸的能力下降，致使血液中甘膽酸含量增加，因此，測定甘膽酸含量可以作為評價肝細胞功能及肝膽系統(tǒng)物質循環(huán)功能的敏感指標之一，也是肝病患者肝功能受損程度及肝病治療恢復效果評價的靈敏度及特異性較好的指標之一。

目前，我國乙型肝炎病毒感染者較多，臨床上各類肝炎患者的數量巨大，乙型肝炎病毒感染者治療不當可能會引起肝硬化等疾病，而甘膽酸含量的測定是診斷乙型肝炎病毒感染和肝硬化的一個重要依據。而且，肝硬化患者血清中甘膽酸(CG)含量與肝硬化代償期分級呈顯著正相關，CG含量指標在判斷肝硬化進展及預后方面優(yōu)于GGT(谷氨酰轉肽酶)、AFP(甲胎蛋白)、AST(谷草轉氨酶)、ALT(谷丙轉氨酶)和血液ALB(白蛋白)含量指標，因此，CG含量測定對肝硬化預后評估價值較大。

近年來，常用的體外定量測定甘膽酸的方法主要有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學發(fā)光免疫法(CL)等。雖然這些方法準確度高、重復性好，但是其同時還均存在較多缺陷，如酶聯(lián)免疫吸附法操作繁瑣、耗時較長，不利于常規(guī)實驗室開展，臨床應用局限性明顯；化學發(fā)光免疫法需要借助于復雜的儀器設備，價格昂貴，不利于推廣使用；放射免疫法存在放射性污染、有效期較短且操作極為不便。因此，建立一種操作簡單快捷、成本低廉的定量測定甘膽酸的檢測分析方法對于臨床中相關疾病的診斷及監(jiān)控具有重要意義。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種定量測定血清中甘膽酸的檢測方法，本發(fā)明提供的檢測方法能夠簡便快捷、準確的定量測定血清中的甘膽酸。

本發(fā)明提供了一種定量測定血清中甘膽酸的檢測方法，包括以下步驟：

a)將血清待測樣、甘膽酸熒光標記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合、孵育，得到檢測樣；

其中，甘膽酸熒光標記物由甘膽酸衍生物與4-胺甲基熒光素經偶聯(lián)反應形成；

所述甘膽酸衍生物具有式(Ⅰ)所示結構：

所述甘膽酸熒光標記物具有式(Ⅱ)所示結構：

甘膽酸多克隆抗體是由所述甘膽酸衍生物與牛血清蛋白偶聯(lián)所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)對所述檢測樣進行熒光偏振光檢測，獲得偏振光強度；

c)根據所述偏振光強度與預設的甘膽酸標準曲線，得到血清待測樣中甘膽酸的濃度。

優(yōu)選的，所述步驟a)中，甘膽酸熒光標記物工作溶液為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸熒光標記物稀釋到一定稀釋度的稀釋液；

所述甘膽酸熒光標記物工作溶液的稀釋度為1∶6500；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸多克隆抗體稀釋到一定稀釋度的稀釋液；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度為1∶750。

優(yōu)選的，所述步驟c)中，預設的甘膽酸標準曲線通過以下方式獲得：

用PBS緩沖液將甘膽酸配制成系列濃度的甘膽酸標準液；

對所述系列濃度的甘膽酸標準液、甘膽酸熒光標記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經混合孵育所得的系列總混合液進行熒光偏振光檢測，獲得系列總混合液的系列偏振光強度mP；

對PBS緩沖液、甘膽酸熒光標記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經混合孵育所得的總空白液進行熒光偏振光檢測，獲得總空白液的偏振光強度mP₀；

根據mP/mP₀的比值和相應的甘膽酸標準液的濃度，獲得甘膽酸標準曲線。

優(yōu)選的，所述甘膽酸熒光標記物工作溶液中，硼酸鹽緩沖液的濃度為1～8mmol/L，PH值為7.0～8.5；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液中，硼酸鹽緩沖液的濃度為1～8mmol/L，PH值為7.0～8.5。

優(yōu)選的，所述PBS緩沖液的濃度為0.01mol/L，PH值為7.4。

優(yōu)選的，所述步驟a)中，血清待測樣、甘膽酸熒光標記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比為1：10：10。