[發(fā)明專利]一種定量測(cè)定血清中甘膽酸的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710581770.3
• 申請(qǐng)日: 2017-07-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107247044A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙肅清;沈定;陳瑩珊;何綺怡;梁文星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

1.一種定量測(cè)定血清中甘膽酸的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)將血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合、孵育，得到檢測(cè)樣；

其中，甘膽酸熒光標(biāo)記物由甘膽酸衍生物與4-胺甲基熒光素經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)形成；

所述甘膽酸衍生物具有式(Ⅰ)所示結(jié)構(gòu)：

所述甘膽酸熒光標(biāo)記物具有式(Ⅱ)所示結(jié)構(gòu)：

甘膽酸多克隆抗體是由所述甘膽酸衍生物與牛血清蛋白偶聯(lián)所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)對(duì)所述檢測(cè)樣進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得偏振光強(qiáng)度；

c)根據(jù)所述偏振光強(qiáng)度與預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟a)中，甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸熒光標(biāo)記物稀釋到一定稀釋度的稀釋液；

所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度為1∶6500；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸多克隆抗體稀釋到一定稀釋度的稀釋液；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度為1∶750。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟c)中，預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)以下方式獲得：

用PBS緩沖液將甘膽酸配制成系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液；

對(duì)所述系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經(jīng)混合孵育所得的系列總混合液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列總混合液的系列偏振光強(qiáng)度mP；

對(duì)PBS緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經(jīng)混合孵育所得的總空白液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得總空白液的偏振光強(qiáng)度mP₀；

根據(jù)mP/mP₀的比值和相應(yīng)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，獲得甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液中，硼酸鹽緩沖液的濃度為1～8mmol/L，PH值為7.0～8.5；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液中，硼酸鹽緩沖液的濃度為1～8mmol/L，PH值為7.0～8.5。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PBS緩沖液的濃度為0.01mol/L，PH值為7.4。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟a)中，血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比為1：10：10。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合孵育時(shí)，甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比為1：10：10；

PBS緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合孵育時(shí)，PBS緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比為1：10：10。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述甘膽酸熒光標(biāo)記物通過(guò)以下方式獲得：

將所述甘膽酸衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基二亞胺溶于二甲基甲酰胺中，形成混合液；

將所述混合液與4-胺甲基熒光素混合反應(yīng)，得到反應(yīng)液；

第一次以體積比為4∶1的CHCl₃和CH₃OH的混合物為展開(kāi)劑，第二次以CH₂Cl₂為展開(kāi)劑，采用TLC薄層色譜純化方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行兩次薄層層析和分離提純，得到甘膽酸熒光標(biāo)記物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在采用TLC薄層色譜純化方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行薄層層析和分離提純后，用甲醇萃取，得到具有不同Rf值的分離物，選擇Rf值為0.47的分離物為甘膽酸熒光標(biāo)記物。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟a)中，甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度通過(guò)以下方式獲得：

用硼酸鹽緩沖液將所述甘膽酸熒光標(biāo)記物稀釋成系列稀釋度的標(biāo)記物供試液并進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列稀釋度的標(biāo)記物供試液的偏振光強(qiáng)度；

以硼酸鹽緩沖液為空白溶液并進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得空白溶液的偏振光強(qiáng)度；

選擇偏振光強(qiáng)度為空白溶液偏振光強(qiáng)度10～15倍的標(biāo)記物供試液的稀釋度為甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度通過(guò)以下方式獲得：

用硼酸鹽緩沖液將甘膽酸多克隆抗體稀釋成系列稀釋度的抗體供試液，分別與所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液混合、孵育，得到系列抗體-標(biāo)記物混合液；

分別對(duì)所述系列抗體-標(biāo)記物混合液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列抗體-標(biāo)記物混合液的偏振光強(qiáng)度；

根據(jù)系列抗體-標(biāo)記物混合液的偏振光強(qiáng)度和相應(yīng)的抗體供試液的稀釋度，獲得抗體供試液曲線；

選擇抗體供試液曲線中最大偏振光強(qiáng)度的70％為標(biāo)準(zhǔn)偏振值，以所述標(biāo)準(zhǔn)偏振值所對(duì)應(yīng)的稀釋度為甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度。