[發明專利]表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體

在審

• 申請號: 201710581141.0
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107164408A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 王隆柏;周倫江;吳學敏;陳秋勇;王晨燕;車勇良;劉玉濤
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C07K19/00
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙)35212
• 代理人: 宋連梅

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體。

背景技術

豬流行性腹瀉(PED)由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起豬群嘔吐、腹瀉、脫水及死亡為特征的消化道病毒性疾病。該病于1971年首次在英國報道，我國在1984年證實該病在的存在。自2010年下半年以來，由于傳統的PEDV在基因上發生了缺失、插入及變異，導致該病對豬群的致病性增強，造成了大量的豬群發病死亡，損失慘重。目前世界上大多數養豬國家都有發生變異PEDV的報道，尤其以中國、韓國、日本、泰國和美國等國家發病嚴重，給養豬業造成了巨大的經濟損失，并已成為影響全球養豬業健康發展的重要疫病之一。PEDV的基因組長大約在28000bp左右，主要含有4個結構蛋白，分別為S、M、N及E蛋白。目前，已見通過PEDV的單個基因如N、S及M基因段片，通過原核表達方法表達出單基因蛋白，但未見通過PEDV的M和N基因片段，利用Blunt-M2哺乳動物真核表達載體，通過無縫拼接技術，構建出表達PEDV的M+N的雙基因真核表達載體。因此，一種表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的方法的建立，對今后開展該病或其他病原的診斷技術及基因工程疫苗的研究，具有重要意義和應用前景。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的制備方法，以及由該制備方法制備的載體。

本發明的另一個目的是提供轉染了真核表達載體的重組工程細胞。

本發明的再一個目的是提供使用了真核表達載體的融合蛋白的制備方法。

本發明是這樣實現的：

本發明首先提供了一種表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)根據PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-M2表達載體基因的片段序列，設計與合成特異性引物；

(2)以PEDV的cDNA為模板，通過PCR技術分別擴增出M與N基因片段，并進行回收純化，將純化的M基因片段連接到pEASY-Blunt-M2表達載體上，構建出M+Blunt-M2質粒；

(3)以M+Blunt-M2質粒為模板，擴增質粒的基因片段，回收純化M+Blunt-M2基因片段；

(4)采用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通過無縫克隆技術將M+Blunt-M2基因與N基因片段進行重組連接，將連接產物再轉化至Trans 1-T1感受態細胞中，涂布于氨芐青霉素抗性的LB培養基進行培養后，提取M+Blunt-M2+N質粒進行測序鑒定，得到表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體。

所述PEDV優選變異豬流行性腹瀉病毒。

其中步驟(1)所述特異性引物序列如下：

a、M

M-F:ATGTCTAACGGTTTTATTCC

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

b、M2+M

M2+M-F:AAGGGCGATCCGGAACAA

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

c、N

N-F:AGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATCG

N-R:TTGTTCCGGATCGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTCGTTG。

其中步驟(2)在構建M+Blunt-M2質粒時，pEASY-Blunt-M2表達載體與M基因片段的摩爾濃度比為1:7，反應時間按連接片段大小進行，片段長度在0.1-1kb時，反應時間在5-10分鐘，片段長度在1-2kb時反應時間在10-15分鐘，片段長度在2-3kb時反應時間在15-20分鐘，大于3kb時反應時間在20-30分鐘。

優選地，在步驟(3)得到的回收產物中加入DMT酶，降解模板。

其次，本發明提供了由所述制備方法制備的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體。

另外，本發明還提供了利用所述的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體轉染的重組工程細胞。

優選地，所述工程細胞為293T細胞。

最后，本發明還提供了一種表達PEDV的M+N雙基因融合蛋白的制備方法，所述方法包括：培養所述的重組工程細胞，并提取融合蛋白。