[發明專利]表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體

在審

• 申請號: 201710581141.0
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107164408A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 王隆柏;周倫江;吳學敏;陳秋勇;王晨燕;車勇良;劉玉濤
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C07K19/00
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙)35212
• 代理人: 宋連梅

1.一種表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)根據PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-M2表達載體基因的片段序列，設計與合成特異性引物；

(2)以PEDV的cDNA為模板，通過PCR技術分別擴增出M與N基因片段，并進行回收純化，將純化的M基因片段連接到pEASY-Blunt-M2表達載體上，構建出M+Blunt-M2質粒；

(3)以M+Blunt-M2質粒為模板，擴增質粒的基因片段，回收純化M+Blunt-M2基因片段；

(4)采用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通過無縫克隆技術將M+Blunt-M2基因與N基因片段進行重組連接，將連接產物再轉化至Trans 1-T1感受態細胞中，涂布于氨芐青霉素抗性的LB培養基進行培養后，提取M+Blunt-M2+N質粒進行測序鑒定，得到表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體。

2.根據權利要求1所述的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的制備方法，其特征在于：所述PEDV為變異豬流行性腹瀉病毒。

3.根據權利要求1所述的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的制備方法，其特征在于：步驟(1)所述特異性引物序列如下：

a、M

M-F:ATGTCTAACGGTTTTATTCC

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

b、M2+M

M2+M-F:AAGGGCGATCCGGAACAA

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

c、N

N-F:AGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATCG

N-R:TTGTTCCGGATCGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTCGTTG。

4.根據權利要求1所述的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的制備方法，其特征在于：步驟(2)在構建M+Blunt-M2質粒時，pEASY-Blunt-M2表達載體與M基因片段的摩爾濃度比為1:7，反應時間按連接片段大小進行，片段長度在0.1-1kb時，反應時間在5-10分鐘，片段長度在1-2kb時反應時間在10-15分鐘，片段長度在2-3kb時反應時間在15-20分鐘，大于3kb時反應時間在20-30分鐘。

5.根據權利要求1所述的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體的制備方法，其特征在于：在步驟(3)得到的回收產物中加入DMT酶，降解模板。

6.如權利要求1-5任一項所述制備方法制備的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體。

7.一種利用權利要求6所述的表達PEDV的M+N雙基因的真核表達載體轉染的重組工程細胞。

8.根據權利要求7所述的重組工程細胞，其特征在于：所述工程細胞為293T細胞。

9.一種表達PEDV的M+N雙基因融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述方法包括：培養如權利要求7或8所述的重組工程細胞，并提取融合蛋白。