[發明專利]一種腈水解酶重組表達菌株的構建及其高密度發酵方法

有效

• 申請號: 201710580770.1
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107267433B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 許正宏;史勁松;龔勁松;張強;李恒;蔣敏;顧炳琛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明涉及一種腈水解酶組成型表達體系的構建及其在煙酸合成中的應用，屬于工業生物技術領域。所述的腈水解酶組成型表達載體是通過在pET?3b質粒導入惡臭假單胞菌Pseudomonas putida腈水解酶基因編碼序列構建而成，得到重組質粒pET?3b?NIT，轉化至E.coli BL21(DE3)中得到無需進行體外誘導的組成型重組腈水解酶表達菌株，命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli NIT?1，現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.14254。進一步采用pH?stat補料策略進行精確調控以提升菌體密度和腈水解酶產量，并以大腸埃希氏菌游離細胞為催化劑，以3?氰基吡啶為底物，通過批次投料的方式進行連續轉化生產煙酸。本發明提供了一種新的無需體外誘導的組成型重組腈水解酶產生菌，該重組菌可高效表達腈水解酶，生產成本低，周期短，發酵過程無需添加誘導劑，最終獲得的菌體密度大，可有效催化3?氰基吡啶生產煙酸，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于工業生物技術領域，具體涉及采用惡臭假單胞菌通過PCR擴增得到腈水解酶基因，構建無需體外誘導的組成型重組表達體系，并研究其高密度發酵工藝及其在煙酸合成中的應用。

背景技術

煙酸(Nicotinic acid)，化學名為3-吡啶甲酸，又可叫尼克丁酸、維生素B3，對人體正常生長發育具有重要作用，常被應用于醫藥中間體、染料、發光材料、食品添加劑和動物飼料等生產中。煙酸在機體組織中的氧化還原過程中發揮重要作用，具有促進細胞新陳代謝和擴張血管的功能，能夠促進人和動物的生長發育。煙酸作為藥品可防治皮膚病和類似的維生素缺乏癥，具有擴張血管的作用，用于醫治末梢神經痙攣，動脈硬化等病癥。煙酸還可作為具有生理和化學活性的精細中間體、醫藥中間體，用它可以開發一系列高附加值的產品，如煙酸鉻、煙酸肌醇酯、VE煙酸酯、2-氯煙酸等。因此對煙酸的研究具有重要的實際應用價值。

最初，煙酸是通過氧化尼古丁制得，后來逐漸發展到以2-甲基-5-乙基吡啶、3-甲基吡啶以及喹啉等為原料制備；在我國，煙酸生產起步于上個世紀70年代，目前工業生產中主要以 3-甲基吡啶為原料，通過氧化反應制備獲得煙酸，而其中氧化方法主要分為液相氧化法和氣相氧化法，以上方法具有氧化劑價格昂貴，過程復雜，產物難分離，污染高及對生產設備要求也高等缺點。

相比于傳統化學法生產煙酸，生物催化法因其反應條件溫和，無需在強酸、強堿、高溫、高壓等苛刻的條件下進行，因而倍受關注。傳統的重組菌產腈水解酶多數需進行體外誘導，增加了工藝步驟和生產成本，且IPTG對菌體具有一定毒害。構建無需體外誘導的腈水解酶組成型重組表達體系，可避免IPTG使用所導致的生產成本增加及對菌體造成的毒害作用。通過高密度發酵制備大量菌體用于生物催化反應，將進一步降低工藝的生產成本，對于工業規模煙酸的生物合成具有重要的研究意義。

發明內容

本發明的目的是構建一種無需進行體外誘導的腈水解酶組成型重組大腸埃希氏菌 Escherichia coli NIT-1，并研究其高密度發酵工藝，最終應用于煙酸的連續轉化合成。

本發明采用的技術方案是：一種產組成型重組腈水解酶的大腸埃希氏菌的構建，方法如下：

1)腈水解酶基因NIT的擴增：提取惡臭假單胞菌Pseudomonas putida CGMCC 3830基因組，設計上下游引物2PU和3bD，PCR擴增獲得腈水解酶基因NIT，引物序列如下：

2PU：5'-GGAATTCCATATGATGGTTACGTACACGAATAAGTT-3'

3bD：5'-ATTGCTCAGCTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAAC-3'

2)pET-3b重組質粒的制備：利用限制性內切酶對pET-3b質粒進行雙酶切，將同樣酶切后的腈水解酶基因NIT與pET-3b質粒相連，得到重組質粒pET-3b-NIT；