[發(fā)明專利]一種腈水解酶重組表達(dá)菌株的構(gòu)建及其高密度發(fā)酵方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710580770.1
• 申請(qǐng)日: 2017-07-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107267433B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許正宏;史勁松;龔勁松;張強(qiáng);李恒;蔣敏;顧炳琛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

1.一種表達(dá)組成型重組腈水解酶、能轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶合成煙酸的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)NIT-1，現(xiàn)保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路一號(hào)院3號(hào)的中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.14254，保藏日期2017年6月19日。

2.一種權(quán)利要求1所述的大腸埃希氏菌NIT-1的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，將大腸埃希氏菌NIT-1斜面菌種進(jìn)行活化，以2～5％的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的種子培養(yǎng)基中，在30～40℃條件下培養(yǎng)8～16h；按照5～20％接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中，利用pH電極和溶氧電極實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液的pH和溶氧值，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，使溶氧維持在10～20％；在分批發(fā)酵階段，流加25％氨水(V/V)使發(fā)酵液pH不低于6.8，分批發(fā)酵階段葡萄糖消耗完后進(jìn)入補(bǔ)料階段，采用pH-stat補(bǔ)料策略進(jìn)行發(fā)酵，在補(bǔ)料前期，通過(guò)流加氨水的調(diào)控方式設(shè)置pH穩(wěn)定在6.8，每升高0.01即開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；補(bǔ)料中期，設(shè)置pH每升高0.03即開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；補(bǔ)料后期設(shè)置每升高0.05開(kāi)始補(bǔ)料；發(fā)酵轉(zhuǎn)速維持在600rpm以內(nèi)；所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～15g/L，NaCl 0.1～1g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl₂ 0.5～1g/L，葡萄糖5～20g/L，微量元素1～5mL/L；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組分為：葡萄糖500～1000g/L，MgSO₄ 10～20g/L，微量元素10～20mL/L；所述發(fā)酵罐內(nèi)添加終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素；所述的微量元素的組分為：FeCl₃·6H₂O 6g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.58g/L，CaCl₂ 0.2g/L，CuCl₂·2H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.3g/L，EDTA 0.5g/L，pH 6.0～7.0。

3.一種權(quán)利要求1所述的大腸埃希氏菌NIT-1轉(zhuǎn)化合成煙酸的方法，其特征在于：以大腸埃希氏菌NIT-1游離細(xì)胞為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，在pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，在30℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，采用HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中底物殘留情況，采用批次底物投料的模式進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，所述體系中底物投料濃度為100～300mM，最終煙酸累積濃度可達(dá)300～600g/L。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于大腸埃希氏菌NIT-1在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中所采用的濃度，以菌體干重計(jì)為1.5～5.0g/L。