[發明專利]檢測水中銅綠假單胞菌和plcH的引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201710579952.7
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107419013A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 蔡先全;張憲臣;劉恭源;邱德義
• 申請（專利權）人: 蔡先全
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司44345
• 代理人: 吳劍鋒

技術領域

本發明涉及一種檢測水中銅綠假單胞菌及其重要毒力因子堿性蛋 白酶PlcH的雙重微滴式數字PCR檢測試劑盒，本發明還涉及一種采用上 述試劑盒檢測食水中銅綠假單胞菌及plcH的方法。

背景技術

銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa原稱綠膿桿菌。在自然界分 布廣泛，為土壤中存在的最常見的細菌之一。各種水、空氣、正常人的 皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮濕的環 境。該菌是一種常見的環境微生物，因對營養要求不高，善于利用各種 碳源和氨化化合物作為氮源，所以在水、土壤、食品以及醫院等環境中 廣泛存在。美國、加拿大、歐洲、日本、巴西及世界衛生組織對飲用水 中銅綠假單胞菌含量的限定MPN<3/L或每250mL不得檢出。我國《食 品安全國家標準包裝飲用水》(GB19298-2014)，則規定5個水樣中， 每個樣中250mL都不得檢出銅綠假單胞菌。

2009年10月開始，《飲用天然礦泉水》等水相關的食品安全國家 標準先后都將菌落總數這一指標刪除。這一改革雖然具有實際意義，但 客觀來說，使得水生產企業簡化了消毒程序，大大提高了銅綠假單胞菌 超標概率。近年來，各地更是頻現飲用水中銅綠假單胞超標的情況。

已有研究表明，銅綠假單胞菌的plcH基因可能發揮非常的作用，比 如通過作用于細胞表面活性物質顯著影響細胞功能，以多種方式改變先 天免疫反應，plcH在對內皮細胞的選擇性凋亡起作用。

飲用水生產質量的嚴格把控需要對銅綠假單胞菌準確、快速檢測， 同時對銅綠假單胞菌傳播風險進行評估。本發明通過設計針銅綠假單胞 菌和plcH基因的特異引物、探針組合，可了解水中銅綠假單胞菌的分 布和菌株中plcH基因的流行情況。

目前，飲用水相關的很多食品安全標準都要求對銅綠假單胞菌的進 行定量檢測，但對于銅綠假單胞菌的定量檢測主要還是通過傳統方法進 行培養后計數，但傳統方法存在過程繁瑣，周期長等缺點。而常規PCR 方法需要PCR擴增后進行電泳，不僅操作繁瑣，而且不能實現定量檢測。 目前，Southern blot和實時熒光定量PCR是常用的兩種外源基因拷貝數 分析技術，已廣泛用于外源基因拷貝數分析。但這兩種方法也存在一定 缺陷。例如，Southern blot方法分析時工作量大、周期長、操作要求高、 準確性較差，特別是對于多拷貝基因的分析，結果容易偏小。熒光定量 PCR在分析外源基因拷貝數時必須依賴于標準曲線和已知拷貝數的基 因，只是一種相對定量方法，且標準曲線的質量易受到DNA純度、引物 和探針的濃度、反應抑制因子等諸多因素影響；另外，標準曲線必須基 于標準物質建立，而標準物質的種類有限和昂貴價格不能適用于所有的 研究。

微滴數字PCR是近年來興起的一種新的絕對定量技術，它基于單分 子PCR方法來進行計數的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要采用 當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核 酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于 或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器 就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例 和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的基因拷貝數。

但基于微滴數字PCR平臺的拷貝數的分析工作報道較少，針對銅綠 假單胞菌及plcH基因的檢測就更未見報道了。本發明基于微滴式ddPCR 平臺，建立了銅綠假單胞菌及其plcH基因拷貝數分析方法，研究結果為 分析食品安全生物源性風險因子的定量檢測提供了新的方法和借鑒，也 為食品安全質量控制提供了一個技術支撐手段。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種引物且 組分和配比合理，使用方便，檢測快捷，準確，適用于雙重ddPCR檢 測水中銅綠假單胞菌及plcH基因的試劑盒；

本發明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測水中銅綠假單 胞菌及plcH基因的方法，該方法操作簡便、快速，檢測結果準確。

為了達到上述目的，本發明采用以下方案：

一種水中銅綠假單胞菌及plcH基因引物，其特征在于該引物的序 列和探針序列分別為：

上游引物P.AF:TGGTAGTCCACGCCGTAAA

下游引物P.AR:CAGACTGCGATCCGGACTACG

探針P.AP:TCGACCGCCTGGGGAGTACG

上游引物plcHF：TACTGGTCCTACGAGCCCAA