[發明專利]檢測水中銅綠假單胞菌和plcH的引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201710579952.7
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107419013A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 蔡先全;張憲臣;劉恭源;邱德義
• 申請（專利權）人: 蔡先全
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種檢測水中銅綠假單胞菌及耐藥基因plcH的引物，其特征在于該引物和探針組合的序列分別為：

上游引物P.AF:TGGTAGTCCACGCCGTAAA

下游引物P.AR:CAGACTGCGATCCGGACTACG

探針P.AP:TCGACCGCCTGGGGAGTACG

上游引物plcHF：TACTGGTCCTACGAGCCCAA

下游引物plcHR：CCTGGTTCGGTTCGAGTTCA

探針plcHP：TCCGCGAGTTCCACGGCAAC。

2.一種檢測水中銅綠假單胞菌及耐藥基因plcH的數字PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中反應體系包括以下組分：其中2×ddPCR Super Mix 10.0μL，銅綠假單胞菌和plcH正反向引物各0.1-1.0μL、探針各0.1-1.0μL，DNA模板4.0μL。

3.一種檢測水中銅綠假單胞菌及耐藥基因plcH的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、檢測水中提取樣品DNA；

B、將各反應組分加入如權利要求2所述的反應體系，然后加入70.0μl礦物油，混勻后轉移到微滴發生器上自動產生微滴；同時分別取所述試劑盒中的陽性質控、和陰性質控，按照與步驟A相同的方法處理，得到相應的DNA模板；

C、將制備數字PCR混合液制作為油包水PCR微反應,并全部轉移到96孔反應板PCR反應管中；再將96孔反應板在封膜儀上封膜，并置于普通PCR儀進行PCR反應；

D、打開微滴熒光檢測器應用軟件，將PCR反應結束后的96孔反應板直接插入設備，檢測每PCR反應管中微滴的PCR反應情況,最后根據珀松分布定律算出待測基因的拷貝數。

4.根據權利要求3所述的檢測水中銅綠假單胞菌及耐藥基因plcH的方法，其特征在于步驟C中PCR擴增的反應程序按以下步驟進行：

(1)94℃預變性3min；

(2)94℃變性10s，59℃退火1min，共進行40個循環；

(3)98℃酶熱失活10min；

(4)4℃停止反應。

5.根據權利要求3所述的檢測水中銅綠假單胞菌及耐藥基因plcH的方法，其特征在于步驟A中所述提取樣品DNA的具體步驟如下：

50mL水樣直接10000rpm立心10分鐘，或者取50mL水樣通過濾膜過濾，用鑷子夾取濾膜在50mL的離心管用2ml超純水沖洗后再10000rpm離心10分鐘，去上清；加入5mL CTAB提取液，充分混勻；65℃孵育30min，不時振蕩；后8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μL氯仿后用力振蕩，13000g離心10min，轉移上清液600μL到新的2ml離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀溶液顛倒數次后室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μL NaCl溶液將沉淀進行懸浮，再加入350μL氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13000g離心10min，轉移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μL 70％乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50μL TE溶液中。