[發明專利]PDE?5抑制劑膠體金免疫層析試紙條及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 201710579030.6
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107300617A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 馮銳;龍飛;羅莉妮;楊鵬博
• 申請（專利權）人: 廣東志道醫藥科技有限公司;廣州安諾食品科學技術有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及對那非類和拉非類成分的檢測領域，具體涉及一種PDE-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條及其制備和使用方法。

背景技術

5型磷酸二酯酶(PDE-5)屬于環核苷酸水解酶家族，主要存在于陰莖海綿體、平滑肌及血小板中，能特異性地與環鳥苷酸結合，是陰莖中環鳥苷酸代謝失活的主要同工酶。PDE-5抑制劑可選擇性地抑制存在于陰莖海綿體的PDE-5的活性，使局部環鳥苷酸濃度維持在較高的水平，促進海綿體平滑肌松弛、血流量增加達到治療陽痿的效果。目前，已獲準上市的PDE-5抑制劑主要包括西地那非、伐地那非和他達拉非。

近年來，世界各國的科研機構和藥品檢驗部門，不斷報道在天然保健品或中成藥中檢出了違法添加的PDE-5抑制劑，其中不僅包括三種已經獲準上市的藥物，而且還包括它們進行了輕微結構改造的類似物。獲準上市的PDE-5抑制劑藥品是處方藥，會產生不同程度的副作用。但消費者在不知情的情況下服用違法添加的PDE-5抑制劑，主要有以下幾個方面的風險：

①PDE-5抑制劑與硝酸酯藥物相互作用會導致嚴重低血壓；②PDE-5抑制劑的類似物沒有經過臨床研究，存在未知危險因素；③違法添加的PDE-5藥物劑量往往超過安全使用劑量，對身體健康構成嚴重威脅。

目前，檢測PDE-5抑制劑的方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法，核磁共振色譜法等等。但是這些方法設備昂貴、運行費用高、操作過程復雜，不適合在基層部門廣泛開展，普通消費者也無法使用。另外，對于新出現的PDE-5抑制劑藥物的結構類似物，往往會規避常規方法的檢驗，產生假陰性的結果。

免疫檢測方法具有靈敏度高、特異性強、方便快捷、操作簡單、成本低廉，無需借助昂貴的設備等優點，特別是膠體金免疫層析試紙條的出現，更加適合基層部門和普通消費者使用。

目前，市場上已有部分檢測PDE-5抑制劑的膠體金免疫層析試紙條(如西地那非)，但大部分是只能同時檢測一種成分，給實際應用帶來了不便。

發明內容

本發明的目的是針對以上現有技術存在的缺陷，提供一種可同時檢測較多種那非類和拉非類成分的膠體金免疫層析試紙條，可用于壯陽類保健品及中成藥等產品中那非類和拉非類成分的快速檢測和初篩。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種PDE-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條，該試紙條包括PVC底板、樣品墊、金標墊、檢測線、控制線、硝基纖維素膜、吸水墊；所述樣品墊、金標墊、檢測線、控制線、硝基纖維素膜、吸水墊均設置在PVC底板的上方，所述樣品墊設置在PVC底板的一端的邊緣，金標墊設置在樣品墊內側并與樣品墊部分重疊；吸水墊設置在PVC底板的另一端，硝基纖維素膜設置在金標墊與吸水墊之間并分別與兩者部分重疊；檢測線在硝基纖維素膜上靠近金標墊的一端，控制線噴涂在靠近吸水墊的一端，所述樣品墊和金標墊為玻璃纖維膜；金標墊上包被有膠體金標記的那非類通用抗體和拉非類通用抗體混合物；所述檢測線包被那非類通用半抗原(NFA)與載體蛋白的偶聯物，以及拉非類通用半抗原(LFA)與載體蛋白的偶聯物；所述控制線上包被兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗體；所述吸水墊為濾紙；所述那非類通用半抗原(NFA)如式Ⅰ所示，所述拉非類通用半抗原(LFA)如式Ⅱ所示。

本發明所述用于檢測那非類和拉非類成分的PDE-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

1.制備通用半抗原-載體蛋白偶聯物：將那非類通用半抗原(NFA)或拉非類通用半抗原(LFA)與牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)，通過碳二亞胺法、活化酯法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法等方法進行偶聯，制備通用半抗原-BSA偶聯物與通用半抗原-OVA偶聯物；

2.制備那非類通用抗體和拉非類通用抗體：將通用半抗原-BSA偶聯物多次免疫小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞在體外進行融合，制備雜交瘤細胞，將陽性雜交瘤細胞注入小鼠腹腔收集腹水，或以體外細胞培養的收集上清液的方式制備那非類通用抗體和拉非類通用抗體；

3.制備膠體金：以檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，膠體金溶液中膠體金顆粒直徑在20～40nm之間；

4.膠體金標記抗體：在膠體金溶液中加入那非類通用抗體和拉非類通用抗體，其中那非類通用抗體和拉非類通用抗體的比例為1:1，加入上述兩種抗體的量為每毫升膠體金溶液中加入1μg～20μg，加入后混勻，通過離心純化、濃縮，制備成膠體金標記的那非類通用抗體和拉非類通用抗體混合物；