[發(fā)明專利]膀胱癌組織T細胞圖譜模型及其構(gòu)建方法和構(gòu)建系統(tǒng)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710576974.8
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN109251980A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 眭維國;戴勇;馬井生;薛雯
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第一八一醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/10
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 何平

1.一種膀胱癌組織T細胞圖譜模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

設(shè)置疾病組與對照組，其中，疾病組取離體的膀胱癌患者膀胱癌組織的標本待用，對照組取離體的膀胱癌患者膀胱癌旁組織的標本待用；

提取各標本的全基因組DNA；

擴增出TCR的CDR3區(qū)，分別得到疾病組文庫和對照組文庫；

采用高通量測序技術(shù)，對所述疾病組文庫和所述對照組文庫進行測序；

對測序結(jié)果進行分析，構(gòu)建膀胱癌組織T細胞圖譜模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述提取各標本的全基因組DNA，具體包括：

(1)將各標本粉碎成碎片，分別取25mg各標本碎片放入至1.5ml的離心管中，加入180μLbuffer ATL；

(2)加入2μL的蛋白酶K，充分渦旋混合均勻，在56℃孵育直至各標本碎片溶解，在各標本碎片溶解的過程中不斷渦旋使組織充分散開；

(3)加入200μL Buffer AL，渦旋混勻15s，56℃孵育10min直至溶解；

(4)加入200μL無水乙醇，渦旋混勻15s，得到混合液；

(5)將所述混合液加入吸附柱，然后將吸附柱放入收集管中，≥8000rpm離心1min，棄濾液；

(6)加入500μL Buffer AW1，≥8000rpm離心1min，棄濾液；

(7)加入500μL Buffer AW2，14000rpm離心3min，棄濾液；

(8)把吸附柱放到一個新的1.5mL收集管內(nèi)，加入30μL Buffer AE至膜中間，室溫放置1min，14000rpm離心1min；使用30μL洗脫液Buffer AE重復(fù)此步驟；

(9)收集DNA并存放在2℃～8℃冰箱中待用，即得到各標本的全基因組DNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在提取各標本的全基因組DNA之后，以及在擴增出TCR的CDR3區(qū)之前，所述構(gòu)建方法還包括：

檢測全基因組DNA中DNA含量及完整性，檢測是否合格，是則執(zhí)行下一步驟。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，采用熒光定量測定全基因組DNA中DNA含量。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測全基因組DNA中的完整性。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述擴增出TCR的CDR3區(qū)，分別得到疾病組文庫和對照組文庫具體包括：

取各標本的全基因組DNA；

加入引物；

進行多重PCR擴增；

進行電泳檢測回收100bp～190bp的多重PCR產(chǎn)物；

進行末端修復(fù)反應(yīng)，并對產(chǎn)物進行純化；

配制接頭連接反應(yīng)體系對進行末端修復(fù)反應(yīng)后的產(chǎn)物進行接頭連接；

通過PCR反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的DNA片段；

純化，分別得到疾病組文庫和對照組文庫。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述擴增出TCR的CDR3區(qū)，分別得到疾病組文庫和對照組文庫之后，以及在采用高通量測序技術(shù)，對所述疾病組文庫和所述對照組文庫進行測序之前，所述構(gòu)建方法還包括：

分別對所述疾病組文庫和所述對照組文庫進行片段范圍檢測和濃度定量。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，采用高通量測序技術(shù)，對所述疾病組文庫和所述對照組文庫進行測序，具體包括：

稀釋各文庫并使各文庫中的DNA變性；

按照預(yù)期上機數(shù)據(jù)量，稀釋；并將變性稀釋后的文庫加入到FlowCell內(nèi)，與FlowCell上的接頭雜交；

在簇生成平臺cBot上結(jié)合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑完成橋式PCR擴增；

將制備好的FlowCell采用Illumina MiSeq測序系統(tǒng)和TruSeq SBS KIT-HS v3試劑進行上機測序。