[發明專利]一種重組斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201710575781.0
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107312786B
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 王文龍;王金玲;馮陳晨;劉春霞;呼和巴特爾
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/64;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;G01N33/573
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

本發明公開了一種重組斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶的制備方法及應用，通過斯氏副柔線蟲轉錄組測序，預測出的編碼基因與已公布的線蟲數據庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因，用RT?PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴增出特有基因Pj_CPR，克隆測序后，構建到原核表達載體pET30a中，轉化至E.coli BL21，進行誘導表達，用Western?bloting法驗證重組蛋白rCPR的免疫原性。斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因重組蛋白經純化后，建立了家畜斯氏副柔線蟲iELISA檢測方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種重組斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶的制備方法及應用。

背景技術

斯氏副柔線蟲病由斯氏副柔線蟲(Parabronema skrjabini)寄生于駱駝、羊、牛等反芻動物真胃引起,尤以駱駝感染較為嚴重。大量蟲體寄生可導致患畜真胃發生炎癥、出血、潰瘍,嚴重者造成駱駝死亡,對養駝業危害極大，是危害我國養駝業的一種主要寄生蟲病，長期以來,給農牧民帶來了巨大的經濟損失。因此，今后對斯氏副柔線蟲病的監測和防制是駱駝寄生蟲病防治中的重點。

由于駱駝多分布在第三世界國家的落后地區，所以時至今日，國內外關于斯氏副柔線蟲病的研究報道較少。嚴重危害我國駱駝養殖業的斯氏副柔線蟲病的相關研究滯后，在駱駝斯氏副柔線蟲病的防治上，目前存在的主要問題是缺少針對該病的基礎理論研究、缺乏有效的生前診斷方法和防治的新方法。適用于許多寄生性線蟲的糞便蟲卵檢查法用于該病的診斷，檢出率非常低，很難用于臨床實踐。該病的診斷主要依靠死后剖檢(在真胃查找蟲體)，此類診斷方法不能為早期治療提供參考。在實際的生產中，往往是在沒有診斷依據的情況下盲目地給藥驅蟲，造成經濟損失的同時也帶來了諸如毒副作用、出現耐藥蟲株和畜產品獸藥殘留超標等諸多弊端。

當前，在生產實踐中亟待研究斯氏副柔線蟲病的生前診斷方法，為該病的防治提供科學依據，使該病的防治更有針對性，提高防治效果，避免不必要的經濟投入，同時為該病的監測提供科學的監測手段。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種重組斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶的制備方法及應用。該方法通過斯氏副柔線蟲轉錄組測序預測出的編碼基因與已公布的線蟲數據庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因并進行功能注釋，用RT-PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴增出特有基因Pj_CPR，克隆測序后，構建到原核表達載體pET30a中，轉化至E.coli BL21(DE3)，進行誘導表達，用western-bloting法驗證Pj_CPR重組蛋白的免疫原性。

其具體技術方案為：

斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

用于擴增權利要求1所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的特異性PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的克隆、原核表達方法，包括以下步驟：

步驟1、引物設計

根據Pj_CPR的基因序列，用Oligo6.0設計引物，分別在上游引物和下游引物中插入限制性內切酶EcoR I、Xho I酶切位點，引物的合成由華大基因有限公司完成。

步驟2、斯氏副柔線蟲總RNA的提取

按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取試劑說明書提取斯氏副柔線蟲總RNA，具體步驟如下：