[發明專利]一種重組斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201710575781.0
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107312786B
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 王文龍;王金玲;馮陳晨;劉春霞;呼和巴特爾
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/64;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;G01N33/573
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：5所示；斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的特異性PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

2.斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因克隆、重組表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、引物設計

根據Pj_CPR的基因序列，用Oligo6.0設計引物，分別在上游引物和下游引物中插入限制性內切酶EcoR I、Xho I酶切位點，引物的合成由華大基因有限公司完成；

步驟2、斯氏副柔線蟲總RNA的提取

按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取試劑說明書提取斯氏副柔線蟲總RNA，具體步驟如下：

1)樣品的研磨和勻漿：將液氮中保存的斯氏副柔線蟲樣品迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀；然后，向研缽中加入適量的RNAiso Plus，反復吹打，至均一透明；然后，將勻漿液轉移至離心管中，室溫15-30℃靜置5min；12000r/min4℃離心5min；小心吸取上清液，移入新的離心管中；

2)總RNA的提取：向上述勻漿裂解液中加入氯仿，RNAiso Plus的1/5體積量，蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色；室溫靜置5min；12000r/min4℃離心15min；從離心機中小心取出離心管吸取上清液轉移至另一新的離心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10min；12000r/min4℃離心10min；

3)RNA沉淀的清洗：小心棄去上清液；加入與RNAiso Plus等量的75％乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，7500g4℃離心5min后小心棄去上清液；

4)RNA的溶解：打開離心管蓋，室溫干燥沉淀數分鐘；沉淀干燥后，加入適量的RNase-free水溶解沉淀；

步驟3、Pj_CPR基因RT-PCR擴增

以提取的斯氏副柔線蟲總RNA為模板反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，用上述設計的特異性引物PCR擴增Pj_CPR基因并對其特有性進行驗證；PCR擴增反應條件為：預變性94℃5min；變性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35個循環；再延伸72℃10min；PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

步驟4、PCR產物回收

按照Axygen PCR產物回收試劑盒說明書操作，回收Pj_CPR基因PCR產物；

步驟5、PCR回收產物與pMD19-T Simple載體的連接

取200μL離心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收產物和5μL Solution Ⅰ，離心混勻，16℃過夜連接；

步驟6、重組質粒的轉化

按照北京全式金生物技術有限公司Trans1-T1感受態細胞使用說明書操作，將連接產物轉化于Trans1-T1感受態細胞中，涂布于含抗生素Amp的固體LB培養基上，37℃培養過夜；

步驟7、重組克隆菌PCR鑒定

挑取單菌落，接種到含抗生素的液體LB培養基中培養過夜，以培養物做PCR鑒定；

步驟8、重組克隆質粒的雙酶切鑒定

提取重組克隆質粒，用限制性內切酶Xho I和EcoR Ⅰ對重組質粒進行雙酶切和電泳檢測；

步驟9、重組克隆菌測序

經PCR鑒定及質粒雙酶切鑒定均為陽性的重組克隆菌，送北京華大基因公司進行雙向測序；

步驟10、目的基因與表達載體pET30a的連接

將測序正確的克隆菌株和含有pET30a質粒的菌株分別接種于LB培養基中培養過夜，分別提取質粒，用限制性內切酶Xho I和EcoR Ⅰ對重組克隆質粒和pET30a質粒進行雙酶切和電泳檢測，膠回收目的基因片段和pET30a片段；

取200μL離心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表達載體片段、1μL T4 DNA連接酶和1μL buffer，16℃連接過夜；構建重組表達質粒pETCPR如SEQ ID NO:2所示；

步驟11、重組表達質粒轉化感受態細胞

按照北京全式金生物技術有限公司E.coli BL21感受態細胞使用說明書操作，將連接產物轉化于E.coli BL21感受態細胞中，涂布于含卡那霉素的固體LB培養基上37℃培養過夜；

步驟12、重組表達菌的鑒定

對構建的重組表達菌E.coli BL21進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，經PCR鑒定及質粒雙酶切鑒定均為陽性的重組表達菌，送北京華大基因公司進行雙向測序；具體步驟如步驟7、步驟8和步驟9所述；

步驟13、重組表達菌誘導表達條件的優化

分別對重組表達菌誘導表達時間、誘導劑IPTG濃度以及培養溫度進行優化，確定最佳誘導表達條件；

步驟14、重組蛋白表達形式的檢測

確定重組蛋白最佳誘導條件后，誘導表達500mL重組菌，離心收集菌體，將菌體沉淀用PBS洗3遍后，用PBS重懸沉淀，加入溶菌酶，常溫放置1h，-20℃反復凍融，冰浴超聲破碎15min，12000r/min離心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上樣緩沖液煮沸10min，12％SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達形式；

步驟15、重組蛋白包涵體溶解及重組蛋白純化

按最佳誘導條件誘導重組表達菌1L，12000r/min離心10min收集菌體，按上述方法裂解重組表達菌，離心收集裂解物沉淀，將沉淀用8M尿素溶解，12000r/min低溫離心10min，收集上清液，用0.45μm孔徑濾器過濾后按照上海生工Ni⁺柱蛋白純化試劑盒操作步驟純化重組蛋白；

步驟16、重組蛋白western blotting檢測

將純化出的重組Pj_CPR蛋白rCPR進行SDS-PAGE電泳，從制膠板上將蛋白質膠取出，在夾子上放置濾紙、PVDF膜、蛋白膠、濾紙，按順序放好夾住，100V 40min轉膜；轉膜后取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，用現配的5％脫脂乳封閉液常溫微搖封閉2h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，將PVDF膜在1：1000稀釋的感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中4℃孵育過夜；取出PVDF膜TBST洗4min，重復3～4遍，將PVDF膜在辣根過氧化物酶標記的兔抗駱駝多克隆抗體中常溫微搖孵育1h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，用ECL顯色后照相。

3.權利要求1所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因編碼蛋白在制備檢測家畜斯氏副柔線蟲感染過程的產品中的應用。