[發明專利]一種抗PEDV的單克隆抗體及其化學發光方法檢測方法

在審

• 申請號: 201710575302.5
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107286236A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 王隆柏;周倫江;王晨燕;吳學敏;陳如敬;車勇良;劉玉濤
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/569
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生物監測領域，具體涉及一種抗PEDV的單克隆抗體及其化學發光方法檢測方法。

背景技術

豬流行性腹瀉（PED）由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起豬只發生嘔吐、腹瀉、腸炎、脫水以及哺乳仔豬的高死亡率為特征。所有不同階段的豬群均可感染，發病率可達100%，哺乳仔豬的死亡率高達90%以上。在許多養豬業發達的國家都己有此病暴發的報道,尤其是在亞洲、歐洲等地區引起了重大的經濟損失。

PED 首次在1971 年于英國報道，隨后在1978 年該病在比利時和英國首次得到鑒定， 我國于1984 年證實該病在的存在，目前世界上大多數養豬國家都有該病的報道，尤其以韓國、日本、中國、泰國和越南等國家發病嚴重。自2010年秋以來,我國南方部分省份出現了嚴重的仔豬流行性腹瀉,發病情況比先前更為兇猛，造成仔大量的哺乳仔豬發病死亡，尤其是7日齡以內的仔豬死亡率高達100%，給養殖戶造成了巨大的經濟損失，并已成為影響我國養豬業健康發展的重要疫病之一。由于PED與豬傳染性胃腸炎(TGE)在流行病學、臨床癥狀等變化上非常相似這給該病的快速診斷與防治都帶來了一定困難。另外，由于PEDV具有在體外分離培養難度大的特點，在研制單克隆抗體方面大多通過原核表達病毒的某個蛋白，制備抗相應蛋白的單克隆抗體，而通過PEDV疫苗弱毒株，研制出抗PEDV的IgG2a單克隆抗體，并利用單克隆抗體，建立化學方法檢測PEDV方法，未見報道。因此，本研究利用空斑純化技術，從豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎-輪狀病毒的三聯弱毒疫苗中獲得PEDV弱毒株，作為抗原，制備PEDV單克隆抗體，并建立化學發光檢測技術及應用于該病的診斷，對該病的有效診斷與防控具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抗PEDV的單克隆抗體及其化學發光方法檢測方法，主要利用空斑純化技術，從豬流行性腹瀉病毒-豬傳染性胃腸炎-豬輪狀病毒的三聯活疫苗中純化獲得PEDV弱毒，通過細胞培養、梯度離心、免疫小白鼠和制備單克隆抗體核心技術，獲得抗PEDV單克隆抗體雜交瘤細胞株及PEDV IgG2a單克隆抗體，單克隆抗體具有效價高、特異性強及穩定性好等特點。利用PEDV單克隆抗體，通過包被液、單抗包被濃度等系列條件優化，建立了一種檢測PEDV的化學發光檢測方法。該方法具有特異性強、敏感性高、一次性檢測量大及穩定性好等特點,能檢測到0.26ng的病毒。建立的化學發光檢測方法，應用表明與RT-PCR檢測技術的符合率在95%以上，與熒光定量RT-PCR檢測方法符合率100%，適合對PEDV的快速診斷。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用所述PEDV單克隆抗體建立檢測PEDV的化學發光檢測方法，具體包括如下步驟：

（1）抗體包被：采用磷酸鹽緩沖液為包被液，以4ug/ml PEDV單克隆抗體濃度包被于固相載體微孔板上，100ul/孔，37℃孵育2h或4℃過夜，洗滌3次；

（2）封閉：以2.5%BSA作為封閉液體封閉覆蓋微孔板，每孔300ul/孔，4℃過夜，洗板3次；

（3）加樣：依次加入樣品，100ul/孔37℃溫育1小時，洗板3次；

（4）加酶標二抗：加入HRP酶標記的PEDV單克隆抗體，以1:4000稀釋后的液體加100ul/孔，37℃ 45min，洗板6次；

（5）加檢測底物：加入化學發光底物液Thermo Scientific SuperSignal ELISA Femto底物液（購自ThermoFisher）100ul/孔，避光反應3分鐘；

（6）檢測：用發光檢測儀測定發光計數。

HRP酶標記PEDV單克隆抗體的方法通過常規方法標記獲得。

本發明的優點在于：