[發(fā)明專利]一種ST37型艱難梭菌及其單位點變異型ST81的鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710575184.8
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107202834A
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙建宏;李茹鑫;楊靖;孫素菊;李志榮;強翠欣;魏宏蓮;時東彥;翟宇;王曉明;趙杏珍;趙寶鑫;趙峰
• 申請（專利權(quán)）人: 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 石家莊國域?qū)＠虡?biāo)事務(wù)所有限公司13112
• 代理人: 劉曉敏,蘇艷肅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種菌種型別的鑒定方法，具體涉及一種ST37型艱難梭菌及其單位點變異型ST81的鑒定方法。

背景技術(shù)

艱難梭菌(Clostridium difficile，CD)是一種專性厭氧，革蘭陽性的粗大芽孢桿菌，是抗生素相關(guān)性腹瀉和偽膜性腸炎(PMC)的主要病原體，約30％的抗生素相關(guān)性腹瀉以及90％以上的偽膜性腸炎由艱難梭菌引起。艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD)的臨床表現(xiàn)差異較大，患者癥狀可為輕度腹瀉或重度致死性的偽膜性腸炎。艱難梭菌基因型與患者病情相關(guān)，感染不同的基因型，疾病的發(fā)展和預(yù)后可能完全不同，如感染了高毒力基因型，例如艱難梭菌027/NAP1/BI(PCR-核糖體分型為027，脈沖場凝膠電泳分型為NAP1，限制性內(nèi)切酶分型為BI)可導(dǎo)致嚴(yán)重后果，甚至死亡。

艱難梭菌導(dǎo)致人類腹瀉的主要致病機制與該菌產(chǎn)生的兩種毒素有關(guān)，即腸毒素A(TcdA)和細(xì)胞毒素B(TcdB)，RT027型艱難梭菌是一種毒素A+B+菌株，但是該菌株在我國并不常見，我國等亞洲地區(qū)國家較為廣泛流行的是RT017型，也就是多位點序列分型37型(以下簡稱ST37型)，ST3型和ST54型也較為常見。ST37型艱難梭菌是一種毒素A-B+菌株，即僅產(chǎn)生毒素B，不產(chǎn)生毒素A，卻比A+B+菌株有更強的耐藥特性和致病能力。近年來，由A-B+菌株引起的嚴(yán)重CDI癥狀和醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)流行時有報道，來自韓國的一家三級醫(yī)院的研究表明，相比A+B+菌株，A-B+菌株在偽膜性腸炎(PMC)患者中的檢出率更高，對氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)脂類、林可霉素類等多種抗生素呈高水平耐藥的特性更促使ST37型艱難梭菌在醫(yī)院內(nèi)的廣泛流行。ST81型是ST37型的單位點變異型，二者具有非常相近的親緣關(guān)系和相似的生物學(xué)特性。ST81型與ST37型艱難梭菌均為A-B+變異株，且同樣存在“耐多藥”現(xiàn)象，具有同樣的診斷價值。因此，ST37型艱難梭菌及其單位點變異型ST81型的快速鑒定對CDI的防控和治療用藥的選擇具有極其重要的意義。

傳統(tǒng)的MLST分型技術(shù)需要經(jīng)過細(xì)菌基因組提取，擴增，測序，并將測序結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫比對后，才可知道分型結(jié)果，完整的MLST分型過程需要1～2天的時間，既耗時又耗力，并且操作繁瑣，價格昂貴，無法在臨床實驗室中常規(guī)檢測。當(dāng)院內(nèi)感染暴發(fā)時，MLST對引起院內(nèi)感染的病原體的檢測具有滯后性，無法滿足快速鑒定的實際需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供一種ST37型艱難梭菌及其單位點變異型ST81的鑒定方法，以解決現(xiàn)有鑒定方法操作繁瑣、耗時長且無法用于常規(guī)檢測的問題。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種ST37型艱難梭菌及其單位點變異型ST81的鑒定方法，包括以下步驟：提取待鑒定艱難梭菌菌株中的蛋白質(zhì)，得到質(zhì)譜測試樣品；利用質(zhì)譜檢測設(shè)備對上述樣品進行檢測，所得質(zhì)譜圖中在m/z3235～3245和m/z3280～3290處同時存在特異性的蛋白峰的菌株為ST37型艱難梭菌或其單位點變異型ST81。

本發(fā)明方法中，采用乙醇/甲酸法提取待鑒定艱難梭菌菌株中的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明方法中，所述質(zhì)譜測試樣品按照以下步驟制備：取5～10mg新鮮培養(yǎng)的艱難梭菌菌株充分懸浮于300μL超純水中，再加入900μL無水乙醇，充分混勻后，12000×g離心2min，棄去上清液，向沉淀中加入20μL 70％甲酸水溶液(由70μL甲酸和30μL水配成)并混勻，再加入20μL乙腈，充分振蕩混勻，12000×g離心2min，吸出上清放于干凈的EP管(即離心管)中，將含有艱難梭菌蛋白質(zhì)提取物的1μL上清液轉(zhuǎn)移到樣品靶板上，室溫下干燥，之后，將1μL CHCA基質(zhì)覆蓋在樣品靶板上，避風(fēng)干燥，即得到質(zhì)譜測試樣品。

本發(fā)明方法中，所用的質(zhì)譜檢測設(shè)備為Microflex LT基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀或VITEK MS全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)。

本發(fā)明首次建立了一種基于MALDI-TOF MS的ST37型艱難梭菌及其單位點變異型ST81的快速鑒定方法，通過檢測質(zhì)譜中是否存在一組特異性的蛋白峰(m/z3235～3245和m/z3280～3290)，即可判定是否為ST37型或其單位點變異型ST81型艱難梭菌，該方法具有實時快速的特點，可以在菌種鑒定的同時將ST37型及其單位點變異型ST81實時篩選出來，鑒定過程不再需要其他的特殊儀器設(shè)備，也不需要額外的操作步驟，對疾病的快速診斷和提供及時的臨床用藥指導(dǎo)具有重要意義，適用于醫(yī)院感染和暴發(fā)流行的監(jiān)測。