[發(fā)明專利]利用HTRF技術(shù)篩選UBC12/Dcn1小分子抑制劑的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710574746.7
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107271687A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉宏民;趙麗杰;鄭一超;王志茹
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/533;G01N33/50;G01N21/64;C12N15/70;C07K19/00;C12R1/84
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所(普通合伙)41104
• 代理人: 時立新

1.利用HTRF技術(shù)篩選UBC12/Dcn1小分子抑制劑的方法，其特征在于，通過如下步驟實現(xiàn)：

(1)GST-Dcn1重組蛋白的表達(dá)純化

（a）GST-Dcn1表達(dá)載體的構(gòu)建：選擇表達(dá)載體PGEX-4T-1及目的基因活性片段GST-Dcn1，將其克隆到表達(dá)載體上;

(b) GST-Dcn1重組蛋白的表達(dá)：將步驟（a）構(gòu)建成功的目的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)表達(dá)菌株中，將菌液均勻涂布到混有抗生素的固體培養(yǎng)基上，挑單克隆篩選出含有目的質(zhì)粒的菌株進(jìn)行培養(yǎng)：表達(dá)蛋白時先將目的菌株接種到液體培養(yǎng)基中37℃進(jìn)行擴大培養(yǎng)，待菌處于生長期OD 0.6-0.9時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)；

所述抗生素選氨芐青霉素，終濃度100μg/ml ；

(c) GST-Dcn1重組蛋白的純化：離心收集步驟（b）菌液中的菌體，然后超聲破碎釋放目的蛋白，高速離心棄去菌體碎片，得到目的蛋白溶液;根據(jù)構(gòu)建表達(dá)載體時選擇的載體特征選擇合適的純化柱、純化條件、緩沖液純化收集蛋白樣品；

(d) 表達(dá)純化結(jié)果：取步驟（c）蛋白純化時收集的蛋白樣品，加入蛋白loading buffer 變性，然后SDS-PAGE膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)染液染膠，在目的蛋白大小處有蛋白條帶;

(2)HTRF技術(shù)篩選UBC12/Dcn1小分子抑制劑平臺的建立

根據(jù)HTRF方法特征選擇檢測試劑，緩沖溶液中，檢測UBC12和Dcn1的相互作用；通過發(fā)射波長665nm時的信號值與620nm時信號值的比值判斷兩種生物分子相互作用的強度，從而篩選UBC12/Dcn1小分子抑制劑。

2.如權(quán)利要求1所述的利用HTRF技術(shù)篩選UBC12/Dcn1小分子抑制劑的方法，其特征在于，HTRF方法中，選：Anti-GST-Cryptate作為能量供體，Streptavidin-d2作為能量受體， Biotin-UBC12濃度為2.84μM， Dcn1濃度為

20nM。