[發明專利]利用HTRF技術篩選UBC12/Dcn1小分子抑制劑的方法

在審

• 申請號: 201710574746.7
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107271687A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 劉宏民;趙麗杰;鄭一超;王志茹
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/533;G01N33/50;G01N21/64;C12N15/70;C07K19/00;C12R1/84
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙)41104
• 代理人: 時立新

技術領域

本發明涉及藥物化學領域，具體涉及利用HTRF技術篩選UBC12/Dcn1小分 子抑制劑的方法。

背景技術

泛素(ubiquitin)可共價結合并修飾細胞內多種蛋白質，使其多聚泛素化被 26S蛋白酶體識別而降解，這種蛋白質翻譯后修飾已經成為當今細胞分子生物學 研究的熱點。目前各種類泛素修飾蛋白也不斷被發現，如SUMO(small ubiquitin-related modifier)、NEDD8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8)、Atg8(autophagy gene 8)和Atg12等。其中，NEDD8與泛素高度 同源，具有60％的一致性和80％的相似性。NEDD8特異性地結合到底物蛋白賴氨 酸殘基上的修飾過程被稱為Neddylation，Neddylation與泛素化類似,也需要經過 NEDD8特異性E1、E2、E3將NEDD8傳遞到底物CRLs(Cullin-RING-ubiquitin ligases)上。NAE(APPBP1/UBA3異質二聚體)活化NEDD8并將其轉移到E2結 合酶UBC12或UBE2F上，然后E2結合酶和E3連接酶相互作用使NEDD8與CRLs 上的cullin蛋白C端賴氨酸殘基結合，進而活化CRLs加速其底物蛋白的降解 (Huang et al.,2009；Leck et al.,2010；Li et al.,2014)。Neddylation通路異常可以誘 發癌癥(Gao et al.,2014；Li et al.,2014)及免疫應答疾病(Le Negrate,2012； Mathewson et al.,2013)。抑制Neddylation通路可以引起細胞周期阻滯、衰老或凋亡，從而 抑制細胞增殖；也可以抑制IκB的泛素化降解從而減少NF-κB的移位和活化，進 而抑制免疫應答疾病。

在neddylation過程中E2結合酶發揮重要作用，首先E2與E1結合，NEDD8傳 遞到E2上與E2形成硫酯鍵。對于RING E3，E2與E3相互作用將NEDD8直接傳遞 到CRLs上。其中，NEDD8從UBC12傳遞到Cullins的過程涉及兩個E3：①RBX1， 一種RING E3，其RING結構域與UBC12和Cullin1相互作用將UBC12的催化活性 位點Cys111和CUL1上NEDD8結合位點Lys720拉近，使NEDD8從UBC12直接傳遞 到CUL1上；②Dcn1(Defective in cullin neddylation 1，也叫做SCCRO、 DCUN1DI)，一種co-E3，是neddylation scaffold-type E3連接酶的組分之一，可以 直接與NEDD8、RBX1和Cullin 1結合(Heir et al.,2013；Huang et al.,2011；Kim et al.,2008；Kurz et al.,2008)。在細胞核內，Dcn1加強Cullin1對UBC12的招募,促進 neddylation，也可催化NEDD8連接到Cullin2的K689。Dcn1晶體結構主要包括UBA 結構域和PONY(potentiating neddylation)結構域兩部分。Dcn1PONY(Dcn1^p) 結構域中兩個EF-hand-like折疊連接處形成一個保守的疏水口袋，與N末端乙酰 化的UBC12相互作用加強neddylation過程(Monda et al.,2013；Scott et al.,2011； Scott et al.,2010)。Dcn1已被報道是一種致癌基因，Dcn1的mRNA和蛋白水平在 多種腫瘤，如肺癌、頭頸癌等及癌癥病人組織中均高表達，Dcn1過表達也可促 進癌細胞的增值和轉移，Dcn1knockdown可以引起癌細胞的周期阻滯和凋亡 (Sarkaria et al.,2006)。綜上所述，通過建立UBC12/Dcn1抑制劑篩選平臺，篩選 出能抑制neddylation通路的化合物對癌癥及免疫性疾病的治療有重要意義，因此， UBC12/Dcn1可以作為一個治療靶點。

發明內容

本發明的目的在于利用HTRF技術建立UBC12/Dcn1抑制劑篩選平臺，篩選出 能抑制neddylation通路的先導化合物。