[發明專利]一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法在審
| 申請號： | 201710573141.6 | 申請日： | 2017-07-14 |
| 公開（公告）號： | CN109251991A | 公開（公告）日： | 2019-01-22 |
| 發明（設計）人： | 田再民 | 申請（專利權）人： | 田再民 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 075000 河北省張家口市橋西區*** | 國省代碼： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 多重PCR 聚丙烯酰胺凝膠電泳 多重PCR擴增 凝膠電泳圖 小麥 擴增產物 小麥品種 小麥種胚 指紋分析 小麥DNA 對引物 條帶 檢測 應用 保證 | ||
1.一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，其特征是：以16個小麥品種為材料，采用CTAB法提取小麥種胚的DNA，以barc80、cfd72、gwm294、gwm429、gwm261、gwm285、gdm72、gwm67、cfd29、cfd76、wmc603、gwm333共12對引物進行多重PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測凝膠電泳圖在目的條帶處是否有產物。
2.如權利要求1所述的一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，其特征在于：多重PCR擴增：選擇16個小麥材料的DNA為模板，每組2對SSR引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為20μL，其中包括：2.0μL 10×buffer，0.4μL dNTPs(10mM)，0.5μL TaqDNA聚合酶(2U/μL)，兩種引物各4.0μL SSR引物(1.25μM)，6.0μL(50-140ng/μL，未去除RNA)模板DNA，3.1μL超純水，PCR反應在5331型PCR儀上進行，PCR擴增程序為降落式PCR，過程包括兩部分，首先，94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃-55℃退火45s，每個循環降低0.7℃，72℃延伸45s，重復11個循環；然后，94℃變性30s；55℃退火45s；72℃延伸45s，重復14個循環；在72℃延伸5min。
3.如權利要求1所述的一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，其特征在于：PCR產物分離：取4μL PCR產物與1.5μL上樣緩沖液混合94℃變性后在6.0％變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，恒壓2000V下，電泳1.5-2.0h，采用簡化的硝酸銀染色方法染色。
4.如權利要求1所述的一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，其特征在于：多重PCR引物組合評估：利用多重PCR組合分析評估引物間相互作用的情況，通過分析出兩對引物各序列間相互作用的最大G值，并用試驗進行驗證。
5.如權利要求1所述的一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，其特征在于：正交試驗設計：對影響PCR反應的Mg2+，TaqDNA聚合酶，dNTPs和引物按四因素三水平L9(34)設計正交試驗。
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