[發明專利]一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法

在審

• 申請號: 201710573141.6
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN109251991A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 田再民
• 申請（專利權）人: 田再民
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明的一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，以16個小麥品種為材料，采用CTAB法提取小麥種胚的DNA，以barc80、cfd72、gwm294、gwm429、gwm261、gwm285、gdm72、gwm67、cfd29、cfd76、wmc603、gwm333共12對引物進行多重PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測凝膠電泳圖在目的條帶處是否有產物，與單一PCR技術相比，多重PCR技術在小麥DNA指紋分析中的應用，其不僅可以保證實驗的穩定性，而且能夠節省時間、人力和物力等。

技術領域

本發明涉及多重PCR技術在小麥DNA指紋分析中的應用，具體涉及一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，屬于農業技術領域。

背景技術

多重PCR(Multiple PCR)是Chambercian等1988年提出，指在同一反應體系中同時進行多個位點的特異性擴增的一類特殊的PCR反應類型，具有快速高效、成本低廉等優點，已成功的在玉米等作物上運用。DNA指紋分析，在進行DNA指紋分析前需要對種子純度和DNA位點一致性進行檢測以排除其對DNA指紋構建的影響，PCR擴增是鑒定工作的基礎。小麥是異源六倍體，其基因組更為復雜，對國家等區域試驗小麥品種進行DNA指紋分析，僅用單一PCR對于DNA指紋分析等種質資源的鑒定工作來說是非常繁重的(時間長、費用高、工作量大)。

利用多重PCR方法對小麥進行DNA指紋分析的研究未見報道，與應用較多的單一PCR技術相比，其不僅可以節省時間，而且可以節省人力和物力等。本方法以多態性和穩定性較好的12對SSR引物，研究多重PCR擴增情況，在此基礎上探討了影響多重PCR擴增效果的因素，并對擴增條帶較弱的引物組合的多重PCR條件進行優化，為多重PCR技術在小麥DNA指紋圖譜的構建和應用奠定基礎。

發明內容

針對上述問題，本發明提供一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法。

本發明采取的技術方案為：

一種基于小麥SSR標記的多重PCR方法，以16個小麥品種為材料，采用CTAB法提取小麥種胚的DNA，以barc80、cfd72、gwm294、gwm429、gwm261、gwm285、gdm72、gwm67、cfd29、cfd76、wmc603、gwm333共12對引物進行多重PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測凝膠電泳圖在目的條帶處是否有產物。

多重PCR擴增：

選擇16個小麥材料的DNA為模板，每組2對SSR引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為20μL，其中包括：2.0μL 10×buffer，0.4μL dNTPs(10mM)，0.5μL TaqDNA聚合酶(2U/μL)，兩種引物各4.0μL SSR引物(1.25μM)，6.0μL(50-140ng/μL，未去除RNA)模板DNA，3.1μL超純水，PCR反應在5331型PCR儀上進行，PCR擴增程序為降落式PCR，過程包括兩部分，首先，94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃-55℃退火45s，每個循環降低0.7℃，72℃延伸45s，重復11個循環；然后，94℃變性30s；55℃退火45s；72℃延伸45s，重復14個循環；在72℃延伸5min。

PCR產物分離：

取4μL PCR產物與1.5μL上樣緩沖液混合94℃變性后在6.0％變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，恒壓2000V下，電泳1.5-2.0h，采用簡化的硝酸銀染色方法染色。

多重PCR引物組合評估：

利用多重PCR組合分析評估引物間相互作用的情況，通過分析出兩對引物各序列間相互作用的最大G值，并用試驗進行驗證。

正交試驗設計：

對影響PCR反應的Mg²⁺，TaqDNA聚合酶，dNTPs和引物按四因素三水平L9(34)設計正交試驗。