[發(fā)明專利]一種基于ddPCR定量檢測ctDNA的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710570752.5 | 申請日: | 2017-07-13 |
| 公開(公告)號: | CN107119145A | 公開(公告)日: | 2017-09-01 |
| 發(fā)明(設計)人: | 廖興華;余承熙;項園;郭瑋;李馥正;王寧;劉義;張同存 | 申請(專利權)人: | 深圳瑞科生物科技有限公司 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68 |
| 代理公司: | 上海精晟知識產(chǎn)權代理有限公司31253 | 代理人: | 馮子玲 |
| 地址: | 518000 廣東省深圳市*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 基于 ddpcr 定量 檢測 ctdna 方法 | ||
技術領域
本發(fā)明涉及血液循環(huán)DNA測定技術領域,具體涉及一種基于ddPCR定量檢測ctDNA的方法。
背景技術
血液循環(huán)DNA(Circulating DNA,ctDNA),又稱游離DNA或無細胞DNA(Cell-free DNA),主要來源于細胞的凋亡和死亡。是腫瘤細胞體細胞DNA經(jīng)脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng),可以被定性、定量和追蹤。對于這類ctDNA的成功捕獲,攜帶信息的準確解讀為癌癥早期基因信息的獲取,癌癥的早期診斷、預后檢測、耐藥評估提供了一條準確的途徑。
但是,這類技術目前仍未得到有效解決和廣泛應用。原因之一在于:ctDNA在外周血中的含量非常低,尤其是與正常DNA(normal DNA,nDNA)相比,其相對含量極低,每10ml全血平均只能提取到50ng左右的游離DNA,目前的檢測技術還難以達到直接檢測外周血中ctDNA的水平。而且,目前的檢測方法均需要先從血清或血漿中提取DNA,然后擴增基因組中某個基因的方式,計算ctDNA的濃度或基因組拷貝數(shù)。由于個體間、不同病理狀態(tài)間ctDNA含量及片段完整程度存在較大差異,即便不考慮操作者的因素,所用提取方法和試劑的不同就會造成提取效率存在巨大差別。在此基礎上的ctDNA測定結果誤差會更大。但直接用血漿或血清擴增,血清或血漿中含有的蛋白質(zhì)等會嚴重干擾PCR,使標本間的擴增效率不一致。
1999年Vogelstein首次提出了“數(shù)字PCR”的概念,“數(shù)字PCR”以其極高的敏感性、絕對計算能力和無需定標等特性疾病診斷工作中得到了廣泛應用。數(shù)字PCR是通過對樣本進行微小單元化處理,可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目,且數(shù)字PCR不依靠任何校準物或外標便可直接計數(shù)目標分子數(shù),為絕對定量PCR技術。因此數(shù)字PCR(digital PCR)特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域:拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的上述不足,提供了一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法,大大提高了檢測的精確性和靈敏度。
為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法,所述方法包括如下步驟:
(1)使用循環(huán)游離DNA提取試劑盒提取血漿循環(huán)游離DNA;
(2)循環(huán)游離DNA的富集:將水相和油相混合、振蕩配成PCR反應體系并進行乳液PCR擴增,分離水相和油相,得到水相的PCR擴增產(chǎn)物,使用特異性結合循環(huán)腫瘤DNA的探針序列捕獲所述水相的PCR擴增產(chǎn)物中的循環(huán)腫瘤DNA;
(3)配置PCR數(shù)字PCR反應體系
配制PCR水相,PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix以及雙蒸水,上述配合的比例關系為0.5-0.7:0.5-0.7:0.5-0.7:0.1-0.2:13-16:41-45,所述PCR模板為步驟(2)中PCR擴增產(chǎn)物;
配制PCR油相,將65%-68%的甘油、5%-10.5%的Trition X-100、5%-10.5%的司盤60、5%-8%的壬基苯基醚IgelCO520依次均勻混合,獲得的溶液作為反應油相備用;
取1體積水相加到3體積的油相中,渦旋攪拌并反應后,得到油包水微滴PCR反應體系;
(4)PCR擴增反應:將上述充分乳化的油水體系分裝,手動轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上,孔板用錫箱熱封后設定PCR反應條件進行PCR擴增,擴增后將96孔PCR板置于QX100A微滴分析儀中,有熒光信號的微滴為陽性,無熒光信號的微滴為陰性。
進一步地,所述步驟(2)中的水相中含有循環(huán)游離DNA模板、正反向引物、dNTPs、PCR緩沖液和DNA聚合酶。
進一步地,所述DNA聚合酶為高保真DNA聚合酶,所述高保真DNA聚合酶為高保真的Klenow Fragment、KAPA HiFi家族高保真DNA聚合酶、Phusion家族高保真DNA聚合酶、Q5家族高保真DNA聚合酶中的任一種。
進一步地,所述水相DNA模板總量1-10ng、正反向引物終濃度為0.1-1μM、dNTPs終濃度為0.5-2mM、PCR緩沖液終濃度為1倍、DNA聚合酶終濃度為0.1-1U。
進一步地,所述步驟(2)中所述探針序列與所述循環(huán)腫瘤DNA特異性結合以后,通過鏈霉親和素磁珠特異性結合生物素而捕獲所述循環(huán)腫瘤DNA。
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