[發明專利]一種基于ddPCR定量檢測ctDNA的方法

在審

• 申請號: 201710570752.5
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107119145A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 廖興華;余承熙;項園;郭瑋;李馥正;王寧;劉義;張同存
• 申請（專利權）人: 深圳瑞科生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術領域

本發明涉及血液循環DNA測定技術領域，具體涉及一種基于ddPCR定量檢測ctDNA的方法。

背景技術

血液循環DNA(Circulating DNA，ctDNA)，又稱游離DNA或無細胞DNA(Cell-free DNA)，主要來源于細胞的凋亡和死亡。是腫瘤細胞體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統，可以被定性、定量和追蹤。對于這類ctDNA的成功捕獲，攜帶信息的準確解讀為癌癥早期基因信息的獲取，癌癥的早期診斷、預后檢測、耐藥評估提供了一條準確的途徑。

但是，這類技術目前仍未得到有效解決和廣泛應用。原因之一在于：ctDNA在外周血中的含量非常低，尤其是與正常DNA(normal DNA，nDNA)相比，其相對含量極低，每10ml全血平均只能提取到50ng左右的游離DNA，目前的檢測技術還難以達到直接檢測外周血中ctDNA的水平。而且，目前的檢測方法均需要先從血清或血漿中提取DNA，然后擴增基因組中某個基因的方式，計算ctDNA的濃度或基因組拷貝數。由于個體間、不同病理狀態間ctDNA含量及片段完整程度存在較大差異，即便不考慮操作者的因素，所用提取方法和試劑的不同就會造成提取效率存在巨大差別。在此基礎上的ctDNA測定結果誤差會更大。但直接用血漿或血清擴增，血清或血漿中含有的蛋白質等會嚴重干擾PCR，使標本間的擴增效率不一致。

1999年Vogelstein首次提出了“數字PCR”的概念，“數字PCR”以其極高的敏感性、絕對計算能力和無需定標等特性疾病診斷工作中得到了廣泛應用。數字PCR是通過對樣本進行微小單元化處理，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，且數字PCR不依靠任何校準物或外標便可直接計數目標分子數，為絕對定量PCR技術。因此數字PCR(digital PCR)特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

發明內容

本發明為了克服現有技術的上述不足，提供了一種基于數字PCR檢測ctDNA的方法，大大提高了檢測的精確性和靈敏度。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的：

一種基于數字PCR檢測ctDNA的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)使用循環游離DNA提取試劑盒提取血漿循環游離DNA；

(2)循環游離DNA的富集：將水相和油相混合、振蕩配成PCR反應體系并進行乳液PCR擴增，分離水相和油相，得到水相的PCR擴增產物，使用特異性結合循環腫瘤DNA的探針序列捕獲所述水相的PCR擴增產物中的循環腫瘤DNA；

(3)配置PCR數字PCR反應體系

配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix以及雙蒸水，上述配合的比例關系為0.5-0.7:0.5-0.7:0.5-0.7：0.1-0.2:13-16:41-45，所述PCR模板為步驟(2)中PCR擴增產物；

配制PCR油相，將65％-68％的甘油、5％-10.5％的Trition X-100、5％-10.5％的司盤60、5％-8％的壬基苯基醚IgelCO520依次均勻混合，獲得的溶液作為反應油相備用；

取1體積水相加到3體積的油相中，渦旋攪拌并反應后，得到油包水微滴PCR反應體系；

(4)PCR擴增反應：將上述充分乳化的油水體系分裝，手動轉移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封后設定PCR反應條件進行PCR擴增，擴增后將96孔PCR板置于QX100A微滴分析儀中，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性。

進一步地，所述步驟(2)中的水相中含有循環游離DNA模板、正反向引物、dNTPs、PCR緩沖液和DNA聚合酶。

進一步地，所述DNA聚合酶為高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶為高保真的Klenow Fragment、KAPA HiFi家族高保真DNA聚合酶、Phusion家族高保真DNA聚合酶、Q5家族高保真DNA聚合酶中的任一種。

進一步地，所述水相DNA模板總量1-10ng、正反向引物終濃度為0.1-1μM、dNTPs終濃度為0.5-2mM、PCR緩沖液終濃度為1倍、DNA聚合酶終濃度為0.1-1U。

進一步地，所述步驟(2)中所述探針序列與所述循環腫瘤DNA特異性結合以后，通過鏈霉親和素磁珠特異性結合生物素而捕獲所述循環腫瘤DNA。