[發(fā)明專利]一種基于ddPCR定量檢測ctDNA的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710570752.5
• 申請(qǐng)日: 2017-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN107119145A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖興華;余承熙;項(xiàng)園;郭瑋;李馥正;王寧;劉義;張同存
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳瑞科生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)使用循環(huán)游離DNA提取試劑盒提取血漿循環(huán)游離DNA；

(2)循環(huán)游離DNA的富集：將水相和油相混合、振蕩配成PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增，分離水相和油相，得到水相的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用特異性結(jié)合循環(huán)腫瘤DNA的探針序列捕獲所述水相的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的循環(huán)腫瘤DNA；

(3)配置數(shù)字PCR反應(yīng)體系：

配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix以及雙蒸水，上述配合的比例關(guān)系為0.5-0.7:0.5-0.7:0.5-0.7：0.1-0.2:13-16:41-45，所述PCR模板為步驟(2)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

配制PCR油相，將65％-68％的甘油、5％-10.5％的Trition X-100、5％-10.5％的司盤60、5％-8％的壬基苯基醚IgelCO520依次均勻混合，獲得的溶液作為反應(yīng)油相備用；

取1體積水相加到3體積的油相中，渦旋攪拌并反應(yīng)后，得到油包水微滴PCR反應(yīng)體系；

(4)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：將上述充分乳化的油水體系分裝，手動(dòng)轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封后設(shè)定PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后將96孔PCR板置于QX100A微滴分析儀中，有熒光信號(hào)的微滴為陽性，無熒光信號(hào)的微滴為陰性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的水相中含有循環(huán)游離DNA模板、正反向引物、dNTPs、PCR緩沖液和DNA聚合酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶為高保真的Klenow Fragment、KAPA HiFi家族高保真DNA聚合酶、Phusion家族高保真DNA聚合酶、Q5家族高保真DNA聚合酶中的任一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法，其特征在于，所述水相DNA模板總量1-10ng、正反向引物終濃度為0.1-1μM、dNTPs終濃度為0.5-2mM、PCR緩沖液終濃度為1倍、DNA聚合酶終濃度為0.1-1U。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述探針序列與所述循環(huán)腫瘤DNA特異性結(jié)合以后，通過鏈霉親和素磁珠特異性結(jié)合生物素而捕獲所述循環(huán)腫瘤DNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法，其特征在于，所述步驟(3)中還包括Illumina測序儀中使用的測序接頭序列，所述測序接頭序列對(duì)應(yīng)的正反向引物序列分別為

5’-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3

和5’-TGAACCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于數(shù)字PCR檢測ctDNA的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中得到的油包水微滴的粒徑為100nm～1μm。