[發明專利]TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710570119.6
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107384961B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 吉林省凱博生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/863
• 分類號: C12N15/863;C12N7/01;A61K39/275;A61P31/20
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明提供一種TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制備方法，首先構建兩種山羊痘病毒穿梭載體pGVTK和pGVTKα，質粒pGVTK包含的核心元件依次為TK基因同源左臂、痘病毒通用早晚期啟動子PE/L、熒光標記基因、轉錄終止子和TK基因同源右臂，質粒pGVTKα包含的核心元件依次為TK基因同源左臂、無意義序列和TK基因同源右臂；然后利用二次同源重組技術特異性敲除TK基因，并可將篩選標記一并敲除，構建得到的TK基因缺失型的山羊痘病毒的毒性有所降低，但是并不影響病毒增殖，仍然保持親本毒株的生長特性，同時還具備良好的遺傳穩定性，適合于山羊痘疫苗的制備，具備良好的安全性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制備方法與應用。

背景技術

山羊痘(goat pox)是山羊的一種高度接觸性傳染病，以發熱、全身痘瘡、結節和死亡為特征。由于該病可造成嚴重的經濟損失、阻礙國際貿易，被世界動物衛生組織(OIE)列為需報告的傳染病，而我國農業部將其列為一類動物疫病。

現有的弱毒疫苗雖然可有效預防該病的發生，但在使用上仍存在較大的安全隱患，難以區分疫苗接種和強毒感染。我國是山羊痘多發的國家，要從根本上控制該病只有啟動根除計劃，因此開展新型疫苗的研制尤為重要。

山羊痘病毒(GTPV)宿主范圍僅限于羊及小反芻獸，對人類不具感染性和致病性，作為活病毒載體研制重組多價疫苗有著明顯的優勢。表達口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒等病原體保護性抗原的重組GTPV不但可以有效預防上述病原體的感染，而且不會干擾這些傳染病常規血清學監測。因此，研制山羊痘病毒載體在防治羊及其他小反芻獸疫病方面具有廣闊的應用前景，但是國內現用的山羊痘弱毒株，雖有較高的免疫力，但接種后仍會刺激局部痘疹反應，嚴重時還可能引起繼發感染而導致動物死亡。特別是發現我國目前的山羊痘弱毒活苗在南方省份對當地品種山羊和進口純種羊的免疫副反應大，常發生全身發痘、孕羊流產等，所以有必要進一步研制出更加安全有效的減毒山羊痘載體。隨著DNA重組技術的發展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速發展，以此構建的新型基因缺失型山羊痘弱毒疫苗不僅可以具有更低的毒力和更高的安全性，還可根據缺失的基因建立有效的診斷方法，因此極有潛力取代傳統疫苗。

鑒于此，采用穩定、高效、安全的DNA重組技術構建基因缺失型的山羊痘病毒具有非常重要的意義。由于山羊痘病毒基因組十分龐大，且其DNA不具有感染性，因而不易通過直接的基因剪切方法將相應基因特異性定點敲除。利用攜帶篩選標記的穿梭載體在感染山羊痘病毒的細胞中與山羊痘病毒進行同源重組，并且在獲得重組山羊痘病毒后再將篩選標記特異性的敲除，成為獲得TK基因缺失型的山羊痘病毒的主要手段。因此，山羊痘病毒TK基因重組臂的選擇和篩選標記的特異性敲除，成為構建TK基因缺失型的山羊痘病毒的基礎和關鍵點。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型的山羊痘病毒穿梭載體。

本發明的另一目的是提供一種新型的TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制備方法。

本發明的又一目的是提供所述TK基因缺失型的山羊痘病毒的應用。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種山羊痘病毒穿梭載體，包括質粒pGVTK和pGVTKα，質粒pGVTK包含的核心元件依次為TK基因同源左臂、痘病毒通用早晚期啟動子PE/L、熒光標記基因、轉錄終止子和TK基因同源右臂，質粒pGVTKα包含的核心元件依次為TK基因同源左臂、無意義序列和TK基因同源右臂。

其中，所述TK基因同源左臂、右臂的核苷酸序列分別如SEQ ID No:1、5所示。所述無意義序列如SEQ ID No:6所示。

優選地，所述熒光標記基因編碼的蛋白為增強型綠色熒光蛋白EGFP；所述轉錄終止子為T5NT。

更優選地，所述痘病毒通用早晚期啟動子PE/L、熒光標記基因、轉錄終止子的核苷酸序列分別如SEQ ID No:2-4所示。