[發(fā)明專利]胚胎植入前染色體異常檢測試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710569713.3
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107267628A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁波;孔令印;劉慧敏;冒燕;宣黎明;申靜靜
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州貝康醫(yī)療器械有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種胚胎植入前染色體異常檢測試劑盒，其特征在于，本試劑盒包括單細(xì)胞擴(kuò)增試劑、片段化試劑、文庫構(gòu)建試劑、DNA純化試劑和陰陽性質(zhì)控品；

其中，

所述的單細(xì)胞擴(kuò)增試劑包括：細(xì)胞提取緩沖液310μl、細(xì)胞裂解緩沖液310μl、細(xì)胞裂解酶20μl、預(yù)擴(kuò)增緩沖液300μl、預(yù)擴(kuò)增酶20μl、擴(kuò)增緩沖液1.5ml和擴(kuò)增酶60μl；

所述的片段化試劑包括：片段化緩沖液120μl、片段化酶120μl和終止反應(yīng)緩沖液300μl；

所述的文庫構(gòu)建試劑包括：末端修復(fù)緩沖液550μl、末端修復(fù)酶27μl、連接緩沖液275μl、DNA連接酶55μl、PCR酶混合液2.6ml、PCR引物混合液137μl、P1接頭60μl、無核酸酶水3.8ml和特異性接頭1～25各8μl；

所述的DNA純化試劑包括：DNA純化磁珠20ml和DNA洗脫液7.8ml；

所述的陰陽性質(zhì)控品包括：核型為21號染色體三體的陽性質(zhì)控品1、核型為XO染色體異常的陽性質(zhì)控品2和染色體核型數(shù)目正常的陰性質(zhì)控品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎植入前染色體異常檢測試劑盒，其特征在于，所述的核型為21號染色體三體的陽性質(zhì)控品由如下方法制備得到：

從核型為21號染色體三體的陽性細(xì)胞樣本中取3～5個細(xì)胞，在-80℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎植入前染色體異常檢測試劑盒，其特征在于，所述的核型為XO染色體異常的陽性質(zhì)控品由如下方法制備得到：

從核型為XO染色體異常的陽性細(xì)胞樣本中取3～5個細(xì)胞，在-80℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎植入前染色體異常檢測試劑盒，其特征在于，所述的染色體正常的陰性質(zhì)控品由如下方法制備得到：

向1mL PBS緩沖液中加入被取樣人的口腔上皮細(xì)胞，200×g的離心力下離心5min后，棄上清，加入1mL PBS緩沖液，再在200×g的離心力下離心5min后，再次棄去上清，所得細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中；從前述的細(xì)胞重懸液中吸取3個細(xì)胞，在-85～-75℃下密封保存?zhèn)溆茫黄渲校龅腜BS緩沖液的濃度為10mmol/L。

5.采用權(quán)利要求1所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于，它包括如下步驟：

(1)單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增：包括依次進(jìn)行的細(xì)胞裂解、預(yù)擴(kuò)增、指數(shù)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物純化四步；

(2)單細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物定量：使用Qubit熒光計和DNA濃度檢測試劑盒檢測步驟(1)中單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增后所得產(chǎn)物的濃度；

(3)基因組DNA片段化：取步驟(1)中所得產(chǎn)物300ng、片段化緩沖液2μl、片段化酶2μl和無核酸酶水，混合后離心，再于37℃下反應(yīng)25min，反應(yīng)結(jié)束后再加入5μl終止反應(yīng)緩沖液，所得混合體系經(jīng)DNA純化磁珠和DNA洗脫液純化后，得到片段化DNA樣本；

其中，步驟(1)中所得產(chǎn)物和無核酸酶水的總體積為16μl；

(4)文庫構(gòu)建：包括依次進(jìn)行的末端修復(fù)、DNA片段末端加接頭、PCR擴(kuò)增DNA片段和文庫定量四步，各步的具體操作為：

末端修復(fù)：取步驟(3)中制備得到的片段化DNA樣本30μl、末端修復(fù)緩沖液10μl、末端修復(fù)酶0.5μl和無核酸酶水9.5μl，混勻后離心，室溫下反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束后所得產(chǎn)物經(jīng)DNA純化磁珠和DNA洗脫液純化后得到平末端DNA；

DNA片段末端加接頭：設(shè)置25組樣品，每組取平末端DNA32μl、無核酸酶水10μl、連接緩沖液5μl、DNA連接酶1μl、P1接頭1μl和特異性接頭1μl；其中，序號1～25的特異性接頭分別加入不同樣品組中；每組樣品混勻后，室溫下反應(yīng)20min；反應(yīng)結(jié)束后所得產(chǎn)物經(jīng)DNA純化磁珠和DNA洗脫液純化后得到25組連接接頭的DNA；

PCR擴(kuò)增DNA片段：取連接接頭的DNA15μl、PCR酶混合液47.5μl和PCR引物混合液2.5μl，混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DNA純化磁珠和DNA洗脫液純化后于4℃下保存，得到25組文庫樣品；

文庫定量：使用Qubit熒光計和DNA濃度檢測試劑盒檢測各組文庫樣品濃度；

(5)測序：選擇25個特異性接頭各不相同的文庫樣本，吸取樣本稀釋到100pM，稀釋倍數(shù)＝Qubit濃度*10⁷/660/300；從各組稀釋后的文庫樣品中取5μl，混合后得到混合文庫樣本；混合文庫樣本上機(jī)測序后，利用胚胎染色體非整倍體檢測數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到每個測序樣本每條染色體的拷貝數(shù)數(shù)值；若某條染色體的拷貝數(shù)數(shù)值大于等于0.37或者小于等于-0.51，則步驟(1)中的待檢測的單細(xì)胞樣本的該條染色體存在非整數(shù)倍體異常。