[發明專利]環介導等溫擴增結合側向流動試紙條檢測錦鯉皰疹病毒

在審

• 申請號: 201710569444.0
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107287351A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 肖勤;劉露;鐘尉方;徐春霞
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,白艷

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種環介導等溫擴增結合側向流動試紙條檢測錦鯉皰疹病毒。

背景技術

錦鯉皰疹病毒病(Koi herpes virus disease，KHVD)于1998年5月在以色列首次發現，到1999年才確認其病原為錦鯉皰疹病毒(Koi herpes virus，KHV)，又稱鯉皰疹病毒III型(CyHV-3)。該病隨后在美國、印尼、英國、歐洲大陸、日本等地區都有大面積爆發。

KHV主要感染錦鯉、鯉魚及其普通變種。潛伏感染KHV的魚體并不表現出臨床癥狀，水溫適宜時會暴發和死亡。該病具有高度傳染性和極強致死率，不僅可以水平傳染，也會垂直傳播。近年來給我國錦鯉、鏡鯉、普通鯉魚的養殖造成了巨大的經濟損失。我國農業部、國家質量監督檢驗檢疫總局聯合公告第2013號公布的《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》里將其列為二類動物疫病，世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須申報的疾病。因此，做好KHV的檢測與監控工作是控制KHV傳播的首要工作。錦鯉皰疹病毒早期檢測是降低其流行風險、減少其發病導致巨額經濟損失的有效手段，所以建立簡單、快速、高靈敏的檢查方法，并開發適用于現場應用的錦鯉皰疹病毒檢測試劑盒顯得尤為重要。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術是Notomi等于2000年報道的一種新型等溫核酸擴增方法(國際專利公開號WO00/28082)，針對靶基因的6個位點設計4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增靶序列，適合于現場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。引入一對環狀引物的改進方法，進一步縮短了反應時間。

橫向流動試紙條(Lateral flow dipstick，LFD)是一種新的檢測方法，反應中FITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產物特異性雜交，避免了瓊脂糖凝膠電泳或熒光染料染色肉眼觀察由非特異性擴增造成的假陽性，進一步提高了反應的特異性和靈敏度。LFD檢測無需特殊的設備，操作者只需將產物和試紙條浸入緩沖液，并且不需有毒試劑，操作簡便且更安全。LAMP-LFD結合技術的檢測結果可以直接肉眼觀察。LFD試紙條上具有控制帶和檢測帶，兩條帶均顯色表示檢測結果為陽性，只有控制帶顯色檢測帶不顯色表明檢測結果為陰性。LAMP-LFD結合方法安全、快捷、高效、高靈敏度，且無設備及技術限制，具有其他技術所無法替代的優勢。

發明內容

本發明一個目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的環介導等溫擴增成套引物。

本發明提供的環介導等溫擴增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游內引物和下游內引物組成；

所述上游外引物的核苷酸序列為序列1；

所述下游外引物的核苷酸序列為序列2；

所述上游內引物的核苷酸序列為序列3；

所述下游內引物的核苷酸序列為序列4。

上述成套引物中，所述上游外引物、所述下游外引物、所述上游內引物和所述下游內引物的摩爾比為1:1:8:8；

或所述上游內引物或所述下游內引物生物素的5’端標記生物素。

本發明另一個目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的環介導等溫擴增試劑。

本發明提供的環介導等溫擴增試劑，包括上述的成套引物、PCR擴增緩沖液和DNA聚合酶；

所述上游外引物和所述下游外引物的濃度均為0.2μmol/L；

所述上游內引物和所述下游內引物的濃度均為1.6μmol/L。

本發明第3個目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的試劑。

本發明提供的試劑，由上述的成套引物和探針組成；

所述探針的核苷酸序列為序列5，

或所述探針的5'端末端異硫氰酸熒光素FITC標記。

本發明第4個目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的試劑盒，包括上述的成套引物或上述的環介導等溫擴增試劑或上述的試劑。

上述的成套引物或上述的環介導等溫擴增試劑或上述的試劑或上述的試劑盒在檢測或輔助檢測錦鯉皰疹病毒中的應用也是本發明保護的范圍；

或，上述的成套引物或上述的環介導等溫擴增試劑或上述的試劑或上述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測錦鯉皰疹病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍；

或上述的成套引物或上述的環介導等溫擴增試劑或上述的試劑或上述的試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣本是否感染錦鯉皰疹病毒中的應用也是本發明保護的范圍；