[發明專利]提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法及應用

在審

• 申請號: 201710569035.0
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107904289A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 宋巖巖;王平存;田振華;于源華;姜金蘭;張曉;張昊
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙)22211
• 代理人: 紀尚

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域。

背景技術

肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，近50年來許多國家報道的肺癌的發病率和死亡率均明顯增高趨勢。由于肺癌的病因至今尚不完全明確以及前期診斷手段的缺失，大多數患者往往不能得益于臨床治療。比如，臨床上最常用的化學治療對非小細胞肺癌也僅有30％-40％的疾病緩解率，且一般不能治愈非小細胞肺癌，只能延長患者生存而且對患者的生活質量有很大影響。

大量研究表明，EGFR基因是肺癌的重要基因靶點，TK類藥物吉非替尼和厄洛替尼等分子藥物對肺癌有很好的療效，而吉非替尼和厄洛替尼的療效與EGFR基因突變狀況密切相關。然而，臨床上TK類藥物并不是對所有的患者有效，因此在臨床用藥選擇時，EGFR基因的診斷特別是占總突變比例較大的外顯子19突變的檢測就顯得尤為重要。

現在，檢測肺癌基因突變的方法最主要是DNA測序法，需要獲取腫瘤組織、分離腫瘤細胞、提取核酸和進行測序，所需時間長，費用高，對取材和技術要求都比較嚴格，因此應用于臨床仍受到一定程度的限制。另還有毛細管電泳法，聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性分析等方法，但它們不僅操作繁瑣，而且需要專門的儀器。用于EGFR基因19外顯子突變檢測的樣本主要包括腫瘤組織樣本和血液樣本，其中組織樣本成份復雜，除了腫瘤組織DNA，也含有部分正常組織DNA，加上腫瘤本生的異質性，其待檢測突變在樣本中所占的比例往往低于20％(測序要求的最低濃度)。血液樣本腫瘤組織DNA含量更少，檢測困難。

發明內容

本發明的目的是：提供一種提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法及應用，通過采用改進型ARMS引物，建立了ARMS法和taqman探針法相結合的方法，大大增加了19外顯子檢測的特異性。

本發明的技術方案是：

本發明的檢測特異性的方法是：特異性擴增EGFR基因19缺失突變位點區域的前引物和后引物，所述的前引物末端與野生型不匹配而與突變型匹配，特別的與常規的ARMS引物相比，本引物末端多出2個錯配位點，并在第4位人為的再引入一個錯配，大大提高了其特異性，有效的防止野生型對檢測的影響。該特異性前引物和后引物一起擴增包含基因突變位點在內的擴增產物的長度為50-200bp；特異性針對擴增產物的taqman探針，其Tm高于引物9-12℃，所述的探針攜帶能檢測的熒光標記。

所述的前引物為ARMS引物，與突變基因存在一個堿基的不同其余完全互補，與野生型存在3-4個堿基不同(常規僅有1個不同)，其余完全互補，長度為17-25bp；較佳地為18-22bp。

經過優化得到的探針序列前引物及后引物序列如下：

探針：

FAM-CGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTG-BHQ1

后引物：

R1：5’-ATGAGAAAAGGTGGGCCTGA-3’

R2：:5’-CTGAGGTTCAGAGCCATG-3’

前引物：2237-2251DEL15 5’-GTCGCTATCAAGGCAGCTC-3’

本發明公開了一種檢測人類EGFR基因突變的應用，包括以下步驟:

(1)提供上述引物和探針；

(2)待測樣品的處理和模板的提取；

(3)配制熒光定量PCR反應體系；

(4)用步驟(1)的引物和探針擴增待測的突變基因靶序列；

(5)利用ARMS引物區分野生型和突變型基因序列，通過監測反應過程中的熒光強度變化來區分野生型和突變型。

所述的檢測人類EGFR基因突變的方法，其中步驟(2)所述的待測樣品包括手術切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病理組織、石蠟切片、全血、血漿、血清或胸腔積液。

經過優化得到的最佳的反應體系為：

其中所用的酶為TAKALA的rTaq酶，總體系為25ul，在保證各組分濃度不變的情況下，也可調整為20ul，也能取得良好的結果。

經過優化得到的反應程序:

94℃ 3min

94℃ 30s

60℃ 10s

40個循環并且在第三步60℃ 10s結束時收集檢測FAM熒光。

本發明的有益效果是：通過采用改進型ARMS引物，建立了ARMS法和taqman探針法相結合的方法，大大增加了19外顯子檢測的特異性。具有靈敏度高特異性好的特點，適合高通量，微量樣本的檢測。

附圖說明