[發明專利]提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法及應用

在審

• 申請號: 201710569035.0
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107904289A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 宋巖巖;王平存;田振華;于源華;姜金蘭;張曉;張昊
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙)22211
• 代理人: 紀尚

1.一種提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法，其方法是：特異性擴增EGFR基因19缺失突變位點區域的前引物和后引物，所述的前引物末端與野生型不匹配而與突變型匹配，特別的與常規的ARMS引物相比，本引物末端多出2個錯配位點，并在第4位人為的再引入一個錯配，大大提高了其特異性，有效的防止野生型對檢測的影響。該特異性前引物和后引物一起擴增包含基因突變位點在內的擴增產物的長度為50-200bp；特異性針對擴增產物的taqman探針，其Tm高于引物9-12℃，所述的探針攜帶能檢測的熒光標記。

2.如權利要求1所述的一種提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法，其方法是：所述的前引物為ARMS引物，與突變基因存在一個堿基的不同其余完全互補，長度為17-25bp。

3.如權利要求1、2所述的一種提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法，其方法是：所述的前引物為ARMS引物，與突變基因存在一個堿基的不同其余完全互補，長度較佳地為18-22bp。

4.如權利要求1所述的一種提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法，其方法是：探針序列前引物及后引物序列如下：

探針

FAM-CGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTG-BHQ1

后引物

R1：5’-ATGAGAAAAGGTGGGCCTGA-3’

R2：:5’-CTGAGGTTCAGAGCCATG-3’

前引物

2237-2251DEL15 5’-GTCGCTATCAAGGCAGCTC-3’。

5.一種提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法的應用，其應用是：

(1)提供上述引物和探針；

(2)待測樣品的處理和模板的提?。?/p>

(3)配制熒光定量PCR反應體系；

(4)用步驟(1)的引物和探針擴增待測的突變基因靶序列；

(5)利用ARMS引物區分野生型和突變型基因序列，通過監測反應過程中的熒光強度變化來區分野生型和突變型。

6.如權利要求5所述的一種提高EGFR基因19外顯子缺失突變檢測特異性的方法的應用，其應用是：

經過優化得到的最佳的反應體系為：

其中所用的酶為TAKALA的rTaq酶，總體系為25ul，在保證各組分濃度不變的情況下，也可調整為20ul，也能取得良好的結果；

經過優化得到的反應程序

94℃ 3min

94℃ 30s

60℃ 10s

40個循環并且在第三步60℃10s結束時收集檢測FAM熒光。