[發明專利]檢測環境中甾體類激素的光學生物傳感器的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201710569026.1
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107505309A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 郭瑞;潘琳;于源華;張昊;宮平;張曉
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙)22211
• 代理人: 紀尚

技術領域

本發明屬于屬于微生物檢測技術領域。

背景技術

甾體類激素是含有環戊烷多氫菲骨架結構的環戊烷多氫菲衍生物，包括性激素與腎上腺皮質激素，在維持生命、調節性功能、免疫疾病治療及生育控制等方面有著極其重要的作用。研究表明，人類和畜禽的排泄物中含有未被分解的甾體類激素如性激素、人工合成激素類藥物等大量排入環境中，人工合成激素類物質能夠模仿生理激素對生物體產生誘導反應，干擾體內代謝信號通路，屬于一類致癌物質。

目前，對于環境甾體類激素的檢測主要以液相與質譜等大型進口儀器為主，價格昂貴、操作復雜、僅適用于實驗室環境檢測，并且僅能檢測單一組分的已知環境甾體類激素污染物，因此迫切需要建立一種快速、靈敏、高通量、實時、原位檢測環境甾體類激素總量的新方法。睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni，C.T.)ATCC 11996中3α-羥類固醇脫氫酶/碳酰基還原酶(3α-HSD/CR)在甾體類激素代謝途徑中發揮至關重要的作用。其基因上游含有10bp回文操縱序列，其基因附近還有一個與3α-HSD/CR基因方向相反的阻遏蛋白基因RepA，在沒有甾體類激素時，阻遏蛋白RepA與10bp回文序列基因相結合，抑制3α-HSD/CR的表達；當有甾體類激素存在時，阻遏蛋白RepA與甾體類激素特異性結合，構象發生改變，從回文序列基因脫離，啟動3α-HSD/CR基因的表達功能。

本發明基于C.T.菌甾體類激素代謝途徑前期研究基礎，即阻遏蛋白RepA與回文序列基因及甾體類激素的特異性結合，采用光干涉生物親和性檢測技術建立一種非標記光學原理的甾體類激素檢測新方法。通過監測dsDNA與RepA的相互作用引起光譜信號偏移，獲得結合解離曲線，非線性擬合獲得相互作用動力學參數；同時建立dsDNA、RepA與甾體類激素間的抑制檢測法，以最大響應信號與甾體類激素濃度建立定量關系，實現甾體類激素的定量檢測，為環境監測領域的生物應用提供新方法。

發明內容

本發明的目的是：提供一種檢測環境中甾體類激素的光學生物傳感器的制備方法及應用，該傳感器表面經親和素修飾后，可以與生物素標記的能夠結合甾體激素的dsDNA結合，形成具有物質特異性的生物傳感膜，采用光干涉生物親和性檢測技術建立一種非標記光學原理的甾體類激素檢測方法，通過監測dsDNA與RepA的相互作用引起光譜信號偏移，獲得結合解離曲線，非線性擬合獲得相互作用動力學參數；同時建立dsDNA、RepA與甾體類激素間的抑制檢測法，以最大響應信號與甾體類激素濃度建立定量關系，實現甾體類激素的定量檢測。

本發明的技術方案如下：

光學生物傳感器，由以下部分組成：石英光纖探針，親和素，生物素標記的特異DNA序列，以及能夠與環境中甾體類激素結合的特異蛋白。光學生物傳感器的制備方法是：

1)利用共價偶聯技術將親和素固定至石英光纖的底端，然后將能夠與甾體類激素發生特異性結合反應的生物素修飾的dsDNA包被于親和素表面，作為傳感器的傳感膜。

2)將傳感器的傳感膜放入到不含有甾體類激素以及激素結合蛋白的樣品孔中，用于觀察探針的穩定性，作為下一步反應的基線。

3)然后將傳感器置于不同濃度的含有甾體類激素以及激素結合蛋白的樣品孔中，未與激素結合的蛋白就會與探針表面固定的特異性分子發生結合反應。

4)隨后將傳感器重新置于被測分子的稀釋溶液中，激素結合蛋白與探針表面固定的特異性分子發生解離反應

5)對每個濃度的結合解離曲線進行分析獲得對應的親和常數。

更為詳細較優的制備方法是：

1)通過共價交聯法，將具有信號放大效應的鏈霉親和素(SA)蛋白固定到光纖探針制備生物親和性檢測SA光纖探針，使得光纖探針能夠與生物素標記的特異的DNA序列結合。

2)通過退火的形式，對合成的單鏈DNA進行復性，獲得生物素標記的雙鏈DNA(Biothin-dsDNA OP1)。

3)將得到的Biothin-dsDNA OP1再進行倍比稀釋，分別固定于光纖探針SA表面，光纖探針表面dsDNA自組裝達到飽和狀態，光譜響應信號不再變化，得到最佳的包被濃度。

4)將生物素修飾的光纖探針固定至Biothin-dsDNA OP1，檢測最大響應信號的相對標準偏差。

5)將梯度稀釋的的睪丸酮標準品與RepA提前孵育，然后將制備好的光纖探針插入到樣品孔中，通過儀器對干涉光譜進行監測，若光譜出現漂移，則證明環境中存在甾體類激素。

本發明的應用是：