[發(fā)明專利]一種熒光定量檢測(cè)PAPP?A的免疫層析試劑條及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710568470.1
• 申請(qǐng)日: 2017-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN107328942A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢純亙;鄒暢;夏福臻;張賽;胡鹍輝;宋永波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司;深圳市人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司44218
• 代理人: 袁燕清

1.一種熒光定量檢測(cè)PAPP-A的免疫層析試紙，其特征在于，所述的免疫層析試紙條包括有PVC底板，其特征在于，所述的PCV底板上依次設(shè)有樣品墊、標(biāo)記墊、包被膜、吸水紙，所述的標(biāo)記墊和所述的樣品墊相接，所述的包被膜和所述的標(biāo)記墊相接，所述的吸水紙和所述的包被膜相接，所述包被膜包含檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔4~8 mm；所述標(biāo)記墊上噴涂有熒光微球標(biāo)記的PAPP-A單克隆抗體和熒光微球標(biāo)記的親和素；所述檢測(cè)線包被有與所述熒光微球標(biāo)記的PAPP-A單克隆抗體處于不同表位的另一種PAPP-A單克隆抗體；所述質(zhì)控線包被有特異性識(shí)別親和素的兔抗親和素抗體。

2.如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙,其特征在于，所述的熒光微球的粒徑為100~500 nm。

3.如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條,其特征在于，所述熒光微球的激發(fā)波長(zhǎng)為310~550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為340~ 620 nm。

4.一種熒光定量檢測(cè)PAPP-A的免疫層析試紙的制備方法,其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟：

（1）熒光微球標(biāo)記蛋白的制備

取熒光微球，10000~15000 rpm第一次離心5~15分鐘，第一次離心分離得到的沉淀物用10~100 mM、pH 6.0~7.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)濃度為0.1%~1%，并超聲分散；加入終濃度為0.1~5 mg/mL的碳二亞胺，混勻，再加入終濃度為0.1~5 mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），混勻；室溫孵育20~40分鐘后10000~15000 rpm第二次離心5~15分鐘，第二次離心分離得到的沉淀物用10~100 mM pH 6.0~7.0磷酸鹽緩沖液溶解，將復(fù)溶后的熒光微球超聲分散，按照0.1~1.0 mg/mL熒光微球的比例分別加入PAPP-A單克隆抗體和親和素，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)1.5~3小時(shí)，10000~15000 rpm第三次離心5~15分鐘，第三次離心分離得到的沉淀物用10~40 mM、pH 7.0-8.0的含10~40 mM乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的Tris-HCl復(fù)溶，超聲分散后旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)0.5~1小時(shí)，10000~15000 rpm第四次離心5~15分鐘，第四次離心分離得到的沉淀物用微球保存液復(fù)溶，2~8℃保存；

（2）樣品墊的預(yù)處理

將樣品墊用封閉液浸泡后，置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24 h后于2~30℃密封保存，所述封閉液含0.1~1%的Triton X-100、0.1~1%的BSA、0.1~2%的PEG 6000、0.005~0.05%的鼠抗人紅細(xì)胞以及0.01~0.05M、pH 8.0的PBS緩沖液；

（3）標(biāo)記墊的制備

將熒光微球標(biāo)記的PAPP-A單克隆抗體和熒光微球標(biāo)記的親和素用標(biāo)記墊處理液噴涂在標(biāo)記墊上，噴量為3~6 μL/cm，所述標(biāo)記墊處理液中含有0.2~2%的酪蛋白、5%~20%的蔗糖、0.1~1%的Tween-20、0.1~0.5%的PEG20000、0.02~0.05%的Proclin300和0.01~0.05M、pH 8.0的Tris-HCL緩沖液，將制備好的標(biāo)記墊置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24 h后于2~30℃密封保存；

（4）包被膜的制備

分別將另一PAPP-A單克隆抗體和兔抗親和素抗體用包被緩沖液將PAPP-A單克隆抗體噴到包被膜上的檢測(cè)線，將兔抗親和素抗體噴到包被膜上的質(zhì)控線，所述PAPP-A單克隆抗體和兔抗親和素抗體的用量按膜包被液量均為0.1~0.2 μL/mm，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔4~8 mm，濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥24~72 h后于2~30℃密封保存，備用；

（5）在底板上順次相互搭接地黏貼樣品墊、標(biāo)記墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，按照切割要求切割成3~4 mm寬度的試紙條。

5.如權(quán)利要求4所述的制備方法， 其特征在于，所述熒光微球標(biāo)記的親和素的濃度為0.1~1.0 mg/mL，按照稀釋比例為0.5%~5%稀釋后，噴量為3~6 μL/cm噴涂至標(biāo)記墊上。

6.如權(quán)利要求4所述的制備方法， 其特征在于，所述包被膜檢測(cè)線上包被的PAPP-A單克隆抗體的濃度為0.5~2 mg/mL。

7.如權(quán)利要求4所述的制備方法， 其特征在于，所述質(zhì)控線上包被的兔抗親和素抗體的濃度為0.5~2 mg/mL。