[發明專利]一種基于豬非典型瘟病毒E2基因的熒光定量RT?PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201710566448.3
• 申請日: 2017-07-12
• 公開（公告）號: CN107267666A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 寧章勇;劉健新;許古明;郭世寧;葛士坤;任旭皎
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 單香杰

技術領域

本發明涉及病毒檢測領域，具體地，涉及一種基于豬非典型瘟病毒E2基因的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。

背景技術

新生仔豬先天性震顫的發生特點是仔豬在出生后發生全身性肌肉陣攣、吮乳困難而導致死亡。趙文遠研究小組于1960年在國內首次發現該病以來，我國獸醫學界進行了大量的探索性研究，但一直無法找到發病的原因。1980年，杜念興研究小組通過一系列試驗基本上確定該病是病毒導致的傳染病，但缺乏直接的證據。2015年，Hause研究小組證實了豬非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus, APPV）可能是仔豬先天性震顫的病原。隨后，德國、荷蘭、奧地利等多個國家先后發現豬群存在APPV流行。華南農業大學寧章勇課題組首次發現了我國豬群APPV感染的發生，并分離了APPV GD1和GD2毒株。APPV為黃病毒科、瘟病毒屬成員，該病毒屬還包括牛病毒性腹瀉病毒1型和2型（BVDV-1和BVDV-2）、豬瘟病毒（CSFV）和邊界病病毒（BDV）及之后發現的其它的瘟病毒（HoBi-like pestivirus）。

目前對于豬非典型瘟尚無疫苗可以應用，檢測豬非典型瘟病毒APPV對于提高對豬非典型瘟的防控能力是非常重要的。目前實驗室病原學檢測方法主要是病毒分離，檢測速度尚不能滿足要求，而且操作比較復雜。已有檢測試劑盒（CN106801109A）靈敏度不高；單純以國外的毒株為模板進行設計，采用簡并引物；僅通過核酸電泳來判斷檢測結果，無法進行定量分析。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術的上述不足，提供一對檢測豬非典型瘟病毒的特異性熒光定量RT-PCR檢測引物。

本發明的另一個目的是提供一種基于豬非典型瘟病毒E2基因的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：

一對檢測豬非典型瘟病毒的特異性熒光定量RT-PCR檢測引物，包括PCR上游引物和PCR下游引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。

與公開號為CN106801109A的檢測試劑盒相比，本發明的試劑盒的區別點和優勢為：(1)引物針對的基因靶標不同：本發明是基于APPV E2（核苷酸序列：2144-2866）基因進行引物的設計，而公開號為CN106801109A的檢測試劑盒是基于APPVNS3基因設計的引物。(2)引物設計的可檢測范圍不同：本發明設計的引物可以針對國內外APPV毒株進行檢測，因為設計的引物同時考慮到了國外現有的毒株和國內的毒株。而公開號為CN106801109A的檢測試劑盒單純以國外的毒株為模板進行設計，所以其引物必須設計成簡并引物，含有未知核苷酸Y（Y代表C或者T）。(3)兩對引物擴增產物長度不同：本發明的引物擴增APPV的E2基因的序列長度為141bp，公開號為CN106801109A的檢測試劑盒引物擴增NS3基因的序列長度為440bp。（4）兩個試劑盒設計的鑒定方法不同：本發明是通過熒光定量PCR，讀取CT值進行鑒定；而公開號為CN106801109A的檢測試劑盒必須進行核酸電泳來判斷。(5)兩者的靈敏度不同：本發明可以檢測到最低為10拷貝/ul的病毒RNA，大約折合0.08ng/ul而公開號為CN106801109A的檢測試劑盒為0.122ng/ul，本發明檢測的靈敏度高于公開號為CN106801109A的檢測試劑盒。(6)對樣品數據的分析不同：本發明建立的熒光定量RT-PCR方法獲得的數據可以對結果進行定量分析，可以鑒別出不同陽性樣品中的病毒滴度的高低，而公開號為CN106801109A的檢測試劑盒只是進行一個陽性和陰性的定性判斷，不同的陽性樣品不能進行毒株含量的高低比較。

SEQ ID NO：1～2所示所述的檢測豬非典型瘟病毒的特異性熒光定量RT-PCR檢測引物在制備豬非典型瘟病毒的檢測試劑盒中的應用。

一種基于豬非典型瘟病毒E2基因的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，含有SEQ ID NO：1～2所示的檢測引物。

所述試劑盒還包含反轉錄反應所需試劑，熒光定量PCR所需試劑，DEPC處理水，陽性對照和陰性對照。

所述陽性對照為含有APPV E2基因片段的T載體克隆，陰性對照為DEPC處理水。

優選地，所述反轉錄反應所需試劑為5×PrimeScript RT Master Mix，熒光定量PCR所需試劑為：SYBR Premix Ex Taq II。