[發(fā)明專利]一種里氏木霉工程菌及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710561319.5
• 申請(qǐng)日: 2017-07-11
• 公開（公告）號(hào): CN109234177A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚斌;蘇小運(yùn);吳毅蘭;羅會(huì)穎;黃火清;柏映國(guó);王苑;涂濤;馬銳;王亞茹;孟昆;馬建爽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12N15/80;C12N9/04;C12R1/885
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11548
• 代理人: 董濤

本發(fā)明將外源的來自黑曲霉的、具有較好pH耐受性的葡萄糖氧化酶基因(god)轉(zhuǎn)化入里氏木霉并將其表達(dá)，得到可表達(dá)外源葡萄糖氧化酶的轉(zhuǎn)化子TU6god，再在該轉(zhuǎn)化子中過表達(dá)內(nèi)源的與蛋白分泌到胞外相關(guān)的蛋白基因(snc1)，從而篩選到一株葡萄糖氧化酶的活性比出發(fā)菌株酶活顯著提高的轉(zhuǎn)化子Tu6god?snc。Tu6god轉(zhuǎn)化子在MM?Avicel中培養(yǎng)32h后，其葡萄糖氧化酶酶活達(dá)到0.28U/ml；而Tu6god?snc在MM?Avicel中培養(yǎng)44h后，其葡萄糖氧化酶酶活達(dá)到了0.61U/ml，相較于Tu6god，其GOD酶活提高了121％，而出發(fā)菌株Tu?6中，不能測(cè)定到葡萄糖氧化酶酶活。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種里氏木霉工程菌及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

里氏木霉(Trichoderma reesei)具有生物安全性高和易于培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，其胞外纖維素酶系統(tǒng)由60％～80％的外切葡聚糖苷酶，20％～36％的內(nèi)切葡聚糖苷酶和1％的β-葡萄糖苷酶組成，這些酶協(xié)同作用，將纖維素轉(zhuǎn)換成葡萄糖。里氏木霉具有良好的安全性，已長(zhǎng)期應(yīng)用于食品加工業(yè)，是公認(rèn)的GRAS(Generally regarded as safe)菌和美國(guó)FDA認(rèn)證的食品安全菌株。同時(shí)，里氏木霉的發(fā)酵工藝成熟、發(fā)酵成本低，為其投入工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)，但里氏木霉自身并不能分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶。

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)的系統(tǒng)名稱為β-D-葡萄糖:氧1-氧化還原酶(EC1.1.3.4)，可從許多來源的真菌中分離、純化得到，這些真菌主要為曲霉和青霉屬，其中用來生產(chǎn)GOD的主要是黑曲霉。GOD能夠催化β-D-葡萄糖被分子氧氧化生成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，并生成過氧化氫。生成的葡萄糖-δ-內(nèi)酯隨后自發(fā)水解或者在內(nèi)酯酶的作用下水解成葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，可用于葡萄糖生物傳感器制造(測(cè)血糖等)、作為面粉添加劑替代溴酸鉀、生產(chǎn)葡萄糖酸及其鹽、制備生物燃料電池及飼料添加劑等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)葡萄糖氧化酶的里氏木霉，所述里氏木霉含有葡萄糖氧化酶的編碼基因god。

所述葡萄糖氧化酶的編碼基因god是通過表達(dá)載體導(dǎo)入所述里氏木霉的；

所述葡萄糖氧化酶的編碼基因god來源于黑曲霉；再具體的，所述葡萄糖氧化酶的編碼基因god的核苷酸序列為序列表中SEQ ID №：2第26-1896位核苷酸序列。

具體的，所述里氏木霉還過表達(dá)內(nèi)源的與蛋白分泌到胞外相關(guān)的蛋白的編碼基因snc1。

所述過表達(dá)包括通過表達(dá)載體將所述與蛋白分泌到胞外相關(guān)的蛋白的編碼基因snc1導(dǎo)入所述里氏木霉的

所述與蛋白分泌到胞外相關(guān)的蛋白的編碼基因snc1來源于里氏木霉；再具體的，所述與蛋白分泌到胞外相關(guān)的蛋白的編碼基因snc1的核苷酸序列為序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸。

具體的，所述里氏木霉含有重組質(zhì)粒pRS424-cbh1P-god-cbh1T；和/或所述里氏木霉含有重組質(zhì)粒pRS424-pdc1P-snc1-pdc1T；

所述重組質(zhì)粒pRS424-cbh1P-god-cbh1T為將序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的第38-1787位核苷酸、SEQ ID №：2所示核苷酸序列的第26-1896位核苷酸、SEQ ID №：3所示核苷酸序列的第26-1525位核苷酸插入pRS424質(zhì)粒的EcoRI酶切位點(diǎn)后獲得的；

所述重組質(zhì)粒pRS424-pdc1P-snc1-pdc1T為將序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的第26-1521位核苷酸、SEQ ID №：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸、和SEQ ID№：7所示核苷酸序列的第26-1025位核苷酸插入pRS424質(zhì)粒的EcoRI酶切位點(diǎn)后獲得的。