[發明專利]利用核ITS序列進行榛種質鑒定的方法

有效

• 申請號: 201710561274.1
• 申請日: 2017-07-11
• 公開（公告）號: CN107142330B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 趙天田;王貴禧;馬慶華;梁麗松
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院林業研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 北京凱特來知識產權代理有限公司 11260
• 代理人: 鄭立明;趙鎮勇

1.一種利用核ITS序列進行榛種質鑒定的方法，其特征在于，包括一對榛ITS序列的擴增引物：

正向引物：5'-AGTCGTAACAAGGTTTCCGT-3'；

反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTTATATGC-3'；

通過上述一對榛ITS序列的擴增引物進行榛種質鑒定的方法，包括如下步驟：

利用正向引物和反向引物對標準種質進行PCR擴增；

利用正向引物和反向引物對待鑒定的目標種質進行PCR擴增；

將以上兩個步驟得到的擴增序列進行比對，根據比對結果是否一致進行榛種質鑒定；

在利用上述正向引物和反向引物進行PCR擴增步驟前，還需要提取標準種質和目標種質的全基因組DNA。

2.根據權利要求1所述的利用核ITS序列進行榛種質鑒定的方法，其特征在于，所述提取標準種質和待檢測種質的全基因組DNA包括如下步驟：

步驟1、在65℃水浴鍋中預熱2％CTAB提取液和2％β-疏基乙醇；

步驟2、取0.2克葉片，加入液氮充分研磨，然后迅速轉移至2mL離心管中，加入預熱的CTAB提取液1ml，65℃水浴60min，每隔10min輕輕顛倒混勻；

步驟3、水浴結束后，取出離心管冷卻至室溫；13000rpm條件下離心5min，取上清液800μL轉入新離心管；

步驟4、加入800μL V:V＝24∶1的氯仿/異戊醇，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液轉入2mL新離心管；

步驟5、重復步驟4，加入等體積V:V＝24∶1的氯仿/異戊醇，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液轉入2mL新離心管；

步驟6、加入上清液2/3體積的異丙醇和1/10體積的3M NaAc,輕輕顛倒混勻，靜置15min至產生絮狀沉淀；

步驟7、12000rpm條件下離心6min后棄上清液，將底部白色DNA沉淀小心取出，轉入1.5mL新的離心管中，用1000μL 70％的乙醇洗滌兩次，每次13000rpm離心6min，棄乙醇，超凈工作臺風干殘留的酒精；

步驟8、提取產物用100μL TE緩沖液溶解，取2～3μL用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余放置于-20℃保存備用。

3.根據權利要求1所述的利用核ITS序列進行榛種質鑒定的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應體系如下：

4.根據權利要求3所述的利用核ITS序列進行榛種質鑒定的方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為：

(1)94℃預變性4min；

(2)94℃30s，60℃30s，72℃2min，10個循環；

(3)94℃30s，50℃30s，72℃2min，26個循環；

(4)72℃延伸10min；

(5)4℃保存。