[發明專利]一種以薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201710560369.1
• 申請日: 2017-07-11
• 公開（公告）號: CN109234312B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 于盱;梁呈元;房海靈;亓希武;李維林;尚慶文;巢建國
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 張立榮

本發明公開一種以薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化方法，包括下述步驟：步驟1，農桿菌菌株的活化培養；步驟2，薄荷無菌苗的獲得；步驟3，薄荷節間莖段的預培養，步驟4，薄荷節間的遺傳轉化；步驟5，抗性芽的快速增殖。采用本方法成功實現了薄荷莖段的遺傳轉化，獲得了穩定遺傳和快速生長的轉基因陽性植株。

本發明具體涉及一種薄荷遺傳轉化技術鄰域，特別公開一種薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化方法。

背景技術

薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的莖、葉中富含揮發油，被廣泛地應用于食品、醫藥、化妝品、香料、煙草等工業。薄荷全草入藥，用于治療風熱感冒、風溫初起、頭痛、目赤、喉痹、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙痛、蕁麻疹、風疹等。薄荷是我國重要的香料和藥用植物之一，在江蘇、安徽、江西等地廣為栽培，已成為當地重要的農業特種經濟作物。但是在薄荷生產中出現的品種單一、品種退化現象，使薄荷的育種工作越來越引人注目。利用轉基因技術培育薄荷優良新品種，具有目的基因來源廣，可定向改變目標性狀的優點。建立一種高效的遺傳轉化體系是獲得轉基因育種成功的關鍵。目前針對國內薄荷品種的快速繁殖系統主要以帶節莖段為再生材料，謝文申等（2016）報道了一種野薄荷脫毒苗的組織快繁方法，快繁外植體為帶兩葉片的單節莖段，吳濤等（1999）同樣報道了以帶葉片的單節莖段快繁的方法，但這些方法只適合于薄荷品種的大規模擴繁并不適用于遺傳轉化方法。因此，為了便于更好的開展國內中藥薄荷品種的遺傳轉化研究，利用基因工程對現有退化薄荷品種進行改良，必須建立一種完善的中藥薄荷主栽品種的遺傳轉化方法。

發明內容

本發明針對傳統現有技術的不足之處，提供了一種以薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化方法，為該植物分子育種方法提供技術支持。

為了達到上述目的，本發明提供了一種以薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化方法，包括如下步驟：

步驟1，根癌農桿菌菌株的活化培養：將農桿菌在YEB固體培養基上劃線后，放在26～30℃的溫度條件下進行暗培養24～36h后，挑取單菌落接入YEB液體培養基中，并于25～30℃振蕩培養1～2天后，用于外植體浸染；所述的農桿菌為根癌農桿菌LBA4404或EHA105，浸染薄荷節間莖段的菌液OD600＝0 .5～0.8

步驟2，薄荷無菌苗的獲得：將薄荷莖尖用75％的酒精消毒20～40s，再用0 .1％升汞消毒5～10min，無菌水沖洗2～5次后，將消毒后的莖尖，剝去最外層2-3片葉子后接種在MS+6-BA 0 .5～2mg·L^-1+NAA0 .1～0.5mg·L^-1+蔗糖20～50g·L^-1+瓊脂3 .5～4 .5g·L^-1

的培養基上，并在22～28℃，光強1000～2000lx ,每天光照8～12h的條件下培養，獲得薄荷無菌苗。

步驟3，薄荷莖段的預培養：切取薄荷無菌苗第2-4節不帶節的節間莖段作為外植體，接種于預培養基上，并進行預培養，預培養基是MS+6-BA 0 .5～2mg?L^-1+NAA0 .1～0.5mg?L^-1+蔗糖20～50g?L^-1+瓊脂3 .5～4 .5g?L^-1，薄荷莖段的預培養條件是在18～22℃、無光照條件下進行；