[發明專利]一種以薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201710560369.1
• 申請日: 2017-07-11
• 公開（公告）號: CN109234312B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 于盱;梁呈元;房海靈;亓希武;李維林;尚慶文;巢建國
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 張立榮

1.一種以薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化體系方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，根癌農桿菌菌株的活化培養：將農桿菌在YEB固體培養基上劃線后，放在26～30℃的溫度條件下進行暗培養24～36h后，挑取單菌落接入YEB液體培養基中，并于25～30℃振蕩培養1～2天后，用于外植體浸染；所述的農桿菌為根癌農桿菌LBA4404或EHA105，浸染薄荷節間莖段的菌液OD600＝0 .5～0.8；

步驟2，薄荷無菌苗的獲得：將薄荷莖尖用75％的酒精消毒20～40s，再用0 .1％升汞消毒5～10min，無菌水沖洗2～5次后，將消毒后的莖尖，剝去最外層2-3片葉子后接種在MS+6-BA 0 .5～2mg·L^-1+NAA0 .1～0.5mg·L^-1+蔗糖20～50g·L^-1+瓊脂3 .5～4 .5g·L^-1的培養基上，并在22～28℃，光強1000～2000lx ,每天光照8～12h的條件下培養，獲得薄荷離體；

步驟3，薄荷莖段的預培養：切取薄荷無菌苗第2-4節不帶節的節間莖段作為外植體，接種于預培養基上，并進行預培養，預培養基是MS+6-BA 0 .5～2mg?L^-1+NAA0 .1～0.5mg?L^-1+蔗糖20～50g?L^-1+瓊脂3 .5～4 .5g?L^-1，薄荷莖段的預培養條件是在18～22℃、無光照條件下進行；

步驟4，薄荷節間莖段遺傳轉化：選取預培養后的薄荷節間莖段切口處產生膨大的外植體放入步驟1活化好的農桿菌菌液中浸染5～10分鐘，使外植體與農桿菌充分接觸后，并用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液后，再轉入共培養基中，在18～24℃的暗培養條件下進行1～3d，共培養基為MS +蔗糖10～15g·L^-1+瓊脂5～7.0g·L^-1；把共培養后的外植體轉入篩選培養基為MS+TDZ 0 .5～4.0mg·L^-1+ IAA0.2～0.5 mg·L^-1+10~25%椰汁+瓊脂5～7g·L^-1+蔗糖15～30g·L^-1+頭孢霉素200～500mg·L^-1+5～10mg·L^-1潮霉素或30~50mg·L^-1卡那霉素進行篩選培養，直到抗性芽再生；

步驟5，抗性芽快速增殖：切取長度為1 .5～3cm的抗性芽轉接至速增殖培養基為MS+BA0 .1～2.0mg·L^-1+蔗糖10～20g·L^-1+頭孢霉素200～500mg·L^-1+瓊脂5～7g·L^-1+蔗糖15～30g·L^-1，培養條件為溫度25 ℃，光照時間8~10 h，光照強度1500~2000 lx。

2.一種以薄荷節間莖段為外植體的遺傳轉化體系方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，根癌農桿菌菌株的活化培養：將農桿菌LBA4404在YEB固體培養基上劃線后，放在28℃的溫度條件下進行暗培養36h后，挑取單菌落接入YEB液體培養基中，并于28℃振蕩培養2天后，測得菌液OD600＝0.8，用于浸染薄荷不帶節的節間莖段；

步驟2，薄荷無菌苗的獲得：將薄荷莖尖用75％的酒精消毒30s，再用0 .1％升汞消毒10min，無菌水沖洗3次后，將消毒后的莖尖，剝去最外層3片葉子后接種在MS+6-BA2mg·L^-1+NAA0 .2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3 .8g·L^-1的培養基上，并在22～28℃，光強1000～2000lx ,每天光照8～12h的條件下培養，獲得薄荷離體；

步驟3，薄荷莖段的預培養：切取薄荷無菌苗第2-4節不帶節的節間莖段作為外植體，接種于預培養基上，并進行預培養，預培養基是MS+6-BA 2mg?L^-1+NAA0 .2mg?L^-1+蔗糖30g?L^-1+瓊脂3 .8g?L^-1，并在24℃、無光照條件下進行3d的預培養；

步驟4，薄荷節間莖段遺傳轉化：選取預培養后的薄荷節間莖段切口處產生膨大的外植體放入步驟1活化好的農桿菌菌液中浸染10分鐘，使外植體與農桿菌充分接觸后，并用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液后，再轉入共培養基中，在24℃的暗培養條件下進行3d共培養，共培養基為MS +蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.8g·L^-1；把共培養后的外植體轉入篩選培養基為MS+TDZ 3.0mg·L^-1+ IAA0.5mg·L^-1+25%椰汁+頭孢霉素500mg·L^-1+4mg·L^-1潮霉素的MS篩選培養基上進行光照培養40d,進行篩選培養，直到抗性芽再生；

步驟5，抗性芽快速增殖：切取長度為1 .5cm的抗性芽轉接至速增殖培養基為MS+BA0.1～2.0mg·L^-1+蔗糖10～20g·L^-1+頭孢霉素200～500mg·L^-1+瓊脂5～7g·L^-1+蔗糖15～30g·L^-1，培養條件為溫度25 ℃，光照時間8~10 h，光照強度1500~2000 lx。