[發(fā)明專利]一種基于體液中細(xì)胞源性囊泡的多功能載體及制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710556332.1
• 申請日: 2017-07-10
• 公開（公告）號: CN107375234B
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳剛;張偉;龐代文;夏厚福;任建崗;余自力;楊解綱;趙怡芳
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號: A61K9/50
• 分類號: A61K9/50;A61K31/704;A61K45/00;A61K47/46;A61K48/00;A61K49/00;A61P35/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種基于體液中細(xì)胞源性囊泡的多功能載體的制備方法，其步驟是：

(1)收集5mL循環(huán)血或唾液，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，在3-5℃條件下用1800～2200g離心18-22min，取上清，再次在3-5℃條件下用1800～2200g離心18-22min，獲取上清，然后在3-5℃條件下繼續(xù)48000～52000g離心60min，將獲取的沉淀用無菌PBS重懸，重懸后液體凍存于-80℃，獲得體液中細(xì)胞源性微粒；收集5mL循環(huán)血或唾液，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，在3-5℃條件下用1800～2200g離心18-22min，取上清，然后在3-5℃條件下繼續(xù)12000～16500g離心20～40min，取上清，然后在3-5℃條件下繼續(xù)100000～120000g離心60～70min將獲取的沉淀用無菌PBS重懸，重懸后液體凍存于-80℃，獲得體液中細(xì)胞源性外泌體；收集5mL循環(huán)血或唾液，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，在3-5℃條件下用1800～2200g離心18-22min，取上清，再次在3-5℃條件下用1800～2200g離心18-22min，獲取上清，然后在3-5℃條件下繼續(xù)100000～120000g離心60～70min，將獲取的沉淀用無菌PBS重懸，重懸后液體凍存于-80℃，獲得體液中細(xì)胞源性膜性囊泡，所述的細(xì)胞源性膜性囊泡包括體液源性微粒和體液源性外泌體；

(2)將20μg體液中細(xì)胞源性膜性囊泡、50μL超小粒徑發(fā)光材料和150μL電穿孔緩沖液加入到電擊杯中并混勻，設(shè)置電穿孔參數(shù)：輸出脈沖電壓250V，電容250μF，單次脈沖，將電擊杯置于電穿孔儀上，按上述參數(shù)進行電穿孔，電穿孔結(jié)束后，將混合液室溫放置28-32min，最后，將混合液在3-5℃條件下18000g～22000g離心18-22min，棄上清，用150μL PBS重懸沉淀，獲取超小粒徑發(fā)光材料標(biāo)記的體液來源細(xì)胞源性膜性囊泡；

所述的超小粒徑發(fā)光材料為直徑1.8nm的超小錳磁性近紅外量子點，濃度為1mg/mL；

(3)將步驟(2)中獲得的基于體液來源細(xì)胞源性膜性囊泡并經(jīng)超小粒徑發(fā)光材料標(biāo)記的多功能載體、腫瘤化療藥物或siRNA、miRNA用于基因治療的核酸片段，以及電穿孔緩沖液混合，經(jīng)電穿孔方式向該多功能載體內(nèi)載入腫瘤治療藥物或基因治療片段，反應(yīng)參數(shù)同步驟(2)，電穿孔結(jié)束后，將混合液室溫放置28-32min，最后，將混合液在3-5℃條件下18000g～22000g離心18-22min，棄上清，用150μLPBS重懸沉淀，獲取超小粒徑發(fā)光材料標(biāo)記，載有化療藥物或治療基因的體液來源細(xì)胞源性膜性囊泡。