[發明專利]一種鴨疫里默氏菌乳膠凝集抗體檢測試劑盒及其檢測方法和保存方法

有效

• 申請號: 201710555663.3
• 申請日: 2017-07-10
• 公開（公告）號: CN107356752B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 羅玲;羅青平;溫國元;邵華斌;張蓉蓉;張騰飛;王紅琳;汪宏才;盧琴
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

1.一種鴨疫里默氏菌乳膠凝集抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

乳膠檢測試劑、

陽性對照品、

陰性對照品；

其中，所述乳膠檢測試劑是鴨疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳膠試劑，其由下述方法制備得到：

（I）鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的制備；

（II）鴨疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳膠試劑的制備；

其中，

步驟（I）鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的制備包括：

（一）所述鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的表達，具體步驟如下：

（1）將pET-28a(+)-ompA重組質粒轉化至感受態細胞BL21(DE3)；

（2）挑取一個單菌落接種于5ml含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養液中，37℃振蕩培養14h；

（3）取4 ml重組菌液接種于400ml含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、160r/min振蕩培養至OD₆₀₀為0.7~0.75；

（4）按體積比加入0.5%乙醇，同時加入終濃度為1.0mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷，26℃、160r/min誘導12h；

（5）4℃、8000r/min離心10min，棄上清，沉淀用Buffer A或PBS重懸，冰浴超聲破菌，直到液體澄清透明；

（6）4℃、8000 r/min 離心10 min，收集上清，得鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA；

其中，

所述pET-28a(+)-ompA重組質粒由下述方法構建得到：

根據GenBank公布的鴨疫里默氏菌ompA基因全序列，設計特異性引物，并分別在上游與下游插入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點；

上游引物F：5’- CCCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATGTTG-3’，下游引物R：5’- CCGCCTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTAC-3’ ；

將以Ⅰ型鴨疫里默氏菌代表菌株的基因組為模板擴增的ompA基因與原核表達載體pET-28a(+)連接，轉化后挑取20-25個單菌落提取質粒；

（二）鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的純化：

將步驟（一）得到的含有鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的上清經過裝有His-Bind樹脂填料的鎳親和層析柱進行純化；

所述步驟（二）鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的純化的具體過程如下：

（1）先在空柱中加入3ml滅菌去離子水浸潤濾芯，再取5mL Ni-NTA His-Bind樹脂裝入層析柱中，然后加入5個柱體積的結合緩沖液平衡柱子；

（2）將步驟（一）制備好的含有鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的上清加入制備好的層析柱中，速度控制在0.6-1mL/min；

（3）先后加入10個柱體積的結合緩沖液、6個體積的漂洗緩沖液洗掉雜蛋白；

（4）封閉柱子底部，加入5個柱體積的洗脫緩沖液，靜置15min后，打開柱子底部，收集洗脫溶液，重復數次，直至將吸附于柱材料上的目的蛋白全部洗脫；

其中，所述結合緩沖液主要含5mM咪唑，pH7.8；所述漂洗緩沖液主要含60mM咪唑，pH7.8；所述洗脫緩沖液主要含1M咪唑，pH7.8；

所述步驟（II）鴨疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳膠試劑的制備包括下述步驟：

（1）取搖勻的羧化聚苯乙烯乳膠400ul，用pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液洗3遍，12000rpm離心10min，棄上清；再用 pH7.4，0.01M 的PBS洗 3 遍，12000rpm離心10min，棄上清；

（2）沉淀用pH7.4，0.01M 的PBS重懸，逐滴加入2000uL含0.02g EDC的PBS，邊加邊振蕩，于25℃100r/min振搖5h，12000rpm離心20min，棄上清；

（3）沉淀用pH8.0，0.01M硼酸鹽緩沖液2000ul懸浮，洗滌3次后重懸，懸浮乳膠濃度為2%，4℃保存備用；

（4）向步驟（3）制得的懸浮乳膠中逐滴緩慢加入鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA 2000ul，于一定致敏溫度下100r/min振搖一段時間；

（5）加入0.1M乙醇胺20ul，于25℃緩慢振搖10min終止反應，12000rpm離心20min；

（6）沉淀用pH8.0，0.01M硼酸鹽緩沖液洗3遍，再用pH8.0，0.01M硼酸鹽緩沖液4000ul懸浮，25℃100r/min 振搖20min，得致敏好的乳膠檢測試劑；

所述鴨疫里默氏菌重組蛋白ompA的蛋白含量為0.25 mg/mL，所述致敏溫度為25℃，所述振搖時間為4h。