[發明專利]一種敲除AAV受體的方法、敲除了AAV受體的HEK293細胞株及其應用

有效

• 申請號: 201710553164.0
• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107245475B
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發明（設計）人: 李華鵬
• 申請（專利權）人: 廣州派真生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/90;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

本發明涉及基因工程和細胞學領域，具體涉及一種AAV受體敲除方法、敲除AAV受體的HEK293細胞株及其應用；所述被敲除的AAV受體為KIAA0319L；所述敲除方法包括：構建靶向AAVR基因組序列的sgRNA載體；轉染293T細胞，培養得到各克隆細胞；Surveyor基因突變分析試驗；選出AAVR突變的單克??；再選擇出高產AAV的AAVR突變細胞株；鑒定其它潛在突變位點的突變情況；把無其它突變位點的細胞株再擴大，建庫以備生產。本發明的被敲除的AAV受體的HEK293細胞株生產AAV的最終產量比常規HEK293產量高出約50％。

技術領域

本發明涉及基因工程和細胞學領域，具體涉及一種敲除AAV受體的方法、敲除了AAV受體的HEK293細胞株及其應用。

背景技術

目前基因治療從近幾十年來無數科學家的夢想正逐步變成了現實?；蛑委煹妮d體一直是整個基因治療的關鍵，作為基因載體，需要具有安全性、有效性、特異性。多種病毒、非病毒載體經過多年的演變、淘汰，目前重組腺相關病毒(rAAV)載體是公認為符合以上三個標準的基因治療載體。由于AAV的生產得率長期以來提升緩慢，因而臨床應用的普及程度也受此制約。隨著近幾年來第一個被歐盟批準的治療脂肪酸酶缺陷的基因治療藥物Glybera上市，Spark Theraputics公司的治療先天性失明的SPK-RPE65三期臨床表現優秀，AAV作為基因治療載體的方向與道路已完全被證明，但AAV的生產效率仍是基因治療的關鍵瓶頸。一個需要全身性轉導的遺傳疾病需要約1x10¹⁵AAV基因組拷貝數(GC)的顆粒，而這個臨床級別的生產量需要50萬美元。生產上，如果用目前實驗室能力范圍內一次50個15cm盤可獲得1x10¹³GC的生產效率來計算，則需要要生產100次或100倍的生產規模才能得到治療一個病人的總量。

目前AAV的主流生產方法是三質粒轉染HEK293細胞方法。三質粒轉染法簡單、快速，但由于HEK293為貼壁細胞，這種方法在規模上的擴展較有困難。但如果能把貼壁細胞馴化為懸浮細胞，則該方法會打破自身的局限，成為規?；I生產的重要候選方案。把貼壁的HEK293細胞馴化為懸浮細胞近幾年已有人取得成功，但由于原本的生產效率仍是未能滿足需求，因此規模化生產只能靠單一地增加生產規模。

在常規的AAV生產中，已有多篇報道發現了在大部分AAV在HEK293細胞生產AAV過程中分泌到上清中。這一現象使目前的AAV生產方法有了一定的變化，即不再忽略上清中存在的AAV；并且還產生了一個新的AAV生產方式：長時間培養三質粒轉染后的HEK293細胞，并連續地收集上清中的AAV。這一方法據稱可達到原先一次轉染后三天收獲AAV的總量的5倍。但是，上清中的AAV是由HEK293細胞分泌出來，也會因為AAV容易感染HEK293細胞而再次進入HEK293細胞中。感染進入HEK293細胞后的AAV會經歷溶酶體的包含、消化外殼、AAV基因組逃脫溶酶體等步驟，最終會導致已經生產、分泌出來的AAV再次被回收，總AAV產量變低。

由此可見，現有技術生產AAV的產量瓶頸亟待打破，在方法上改進、創新，取得更高的AAV產率是目前基因治療的一大亟待改善的問題。

發明內容

有鑒于此，有必要針對的問題，提供一種敲除AAV受體的方法、敲除了AAV受體的HEK293細胞株及其應用，可將AAV感染HEK293細胞這一途徑阻斷，提升AAV的最終產量。

本發明通過以下技術方案實現：