[發明專利]一種敲除AAV受體的方法、敲除了AAV受體的HEK293細胞株及其應用有效
| 申請號： | 201710553164.0 | 申請日： | 2017-07-07 |
| 公開（公告）號： | CN107245475B | 公開（公告）日： | 2019-07-16 |
| 發明（設計）人： | 李華鵬 | 申請（專利權）人： | 廣州派真生物技術有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/90;C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326 | 代理人： | 劉新年 |
| 地址： | 511370 廣東省廣州市高新技術*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 aav 受體 方法 除了 hek293 細胞株 及其 應用 | ||
【權利要求書】：
1.一種利用敲除了AAV受體的HEK293細胞株制備AAV的方法，其特征在于，操作步驟包括：
(1)鋪敲除了AAV受體的HEK293細胞株至反應孔板中；
(2)將pRC-DJ載體、Ad輔助載體及AAV-EGFP載體加入DMEM中，再加入PEI，馬上混勻，培養；
(3)培養72小時后收集細胞和上清，反復凍融三次，離心得上清即為AAV粗提液；其中，所述HEK293細胞株敲除的是KIAA0319L基因第4個外顯子或第8個外顯子。
2.根據權利要求1所述的利用敲除了AAV受體的HEK293細胞株制備AAV的方法，其特征在于，具體操作步驟包括：
(1)鋪敲除了AAV受體的HEK293細胞株約3x105至24孔板中；
(2)用pRC-DJ載體、Ad輔助載體及AAV-EGFP載體各0.2～2ug，加入0.5ml DMEM中，再加入PEI15ul，馬上混勻，常溫下放置10分鐘后加入細胞培養基中再放回37度細胞培養箱5％CO2濃度條件下培養；
(3)培養72小時后收集細胞和上清，反復凍融三次，10000g離心10分鐘后上清為AAV粗提液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中反復凍融操作為37℃水浴和干冰-乙醇浴中反復凍融，解凍與凍結每次各2分鐘。
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