[發明專利]一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒和應用

在審

• 申請號: 201710552357.4
• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107287314A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 鄒婧;李全;侯強;張春楊;譚宏東
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技有限公司;華大生物科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司11332
• 代理人: 鞏克棟

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種建庫試劑盒及其制備方法和應用，尤其涉及一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒和應用。

背景技術

耳聾是一項非常常見的嚴重影響人類生活的感覺障礙性疾病，其病因復雜，單一的或者多重的基因突變極可能會導致重度耳聾，而受環境因素影響，諸如藥物、創傷、極端環境暴露等，也會突發性致聾。WHO 2013年數據估計全球聽力障礙人數達到3.6億，而據2006年12月公布的全國第二次殘疾人抽樣調查主要數據公報結果顯示，我國的語言聽力障礙人數已高達2780萬，新生兒中每年新增2萬～3萬聾兒，發病率高達1‰～3‰。

遺傳性耳聾具有較高的異質性，即不同耳聾致病基因可導致相同表型的聽覺功能障礙，而同一個基因的不同的突變可以引起不同的臨床表型的耳聾，由此造成耳聾的病因非常復雜。因此，對致聾的遺傳因素的研究成為了探究耳聾病因及有效治療手段的突破口，而有效檢測耳聾相關基因對耳聾的早期防范與治療起到重要作用。目前已定位的致聾基因有150多種，但分子流行病學數據顯示，大多數遺傳性耳聾是由幾個較為常見的熱點突變引起的，中國人群常見耳聾突變主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4以及線粒體的12S rRNA基因突變，在人群中的突變比例高達40％。

在常染色體隱性遺傳的非綜合征性耳聾中，大約有一半是由于GJB2基因突變引起的。GJB2目前報道最多的突變位點是167delT、235delC、35delG和176_191del16。大量文獻顯示，GJB2基因在不同種族中導致耳聾突變的位點上存在很大的差異。在歐美，特別是在北歐、南歐及美國的高加索人中，主要的突變形式是35delG，占所有GJB2突變的70％；另一個突變熱點是167delT，在猶太耳聾人群中多見，占所有病理性突變的40％，35delG突變只占18％；而在亞洲人群中，則主要為235delC突變，在日本和中國，235delC位點突變在人群中的攜帶率為1.0％-1.3％，占所有GJB2病理性等位基因的80％。與GJB2相關的非綜合征性耳聾患者一般情況多為雙耳同時受累，呈對稱性耳聾，多數表現為先天性耳聾，聽力損失程度從輕度到極重度不等，大多數為重度和極重度耳聾，損失程度與突變的類型和位點有關，相同基因型的個體聽力受損程度也存在差異，臨床表現具有多態性，表明基因的表達可能受到修飾基因或者環境的影響。

GJB3基因突變可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳非綜合征性聾。夏家輝院士等于1998年首次在世界上成功克隆了該基因，應用熒光原位雜交技術發現GJB3定位于1p33-p35，并最早報道了兩個GJB3突變位點547G＞A以及538C＞T：他們篩查了42個遺傳性耳聾的家系，在浙江的一個耳聾家系中發現了一個錯義突變，Cx31基因編碼區的第547位堿基由G突變成A，使得連接蛋白Cx31的第183號氨基酸由谷氨酸變成了賴氨酸；同時他們還在湖南一個家系中發現了另一個突變，GJB3的第538位堿基由C變成T，導致第180號氨基酸變為終止密碼子。

SLC26A4基因編碼蛋白質Pendrin。Pendrin屬于溶質蛋白SLC26，通過其轉運功能可實現細胞內外氯/碘離子互換。SLC26A4基因突變和大前庭水管綜合癥以及Pendred氏綜合征有關，臨床表現為先天神經性耳聾伴有不同程度的語言障礙，甲狀腺腫大，CT或MRI顯示耳蝸發育不良，前庭導水管擴大，在中國人群的遺傳性耳聾患者中突變率僅次于GJB2。到目前為止已發現了150多種SLC26A4突變類型，不同人群中突變類型和發生頻率存在很大差異，IVS7-2A>G突變類型在中國大前庭水管綜合癥患者中最常見，有研究證明IVS7-2A＞G亦為始祖效應。

線粒體DNA(mtDNA)是唯一存在于細胞質中的DNA，由于子代的線粒體由卵細胞提供，故線粒體遺傳屬于母系遺傳。氨基糖苷類抗生素致聾患者大部分是1555A>G、1095T>C、1494C>T突變的攜帶者，這些突變增加了個體對氨基糖苷類藥物耳毒性的敏感性，常出現“一針致聾”的情況，通過早期基因檢測，可給出臨床用藥建議，同時由于該突變屬母系遺傳，可對家系所有母系成員均起到警戒作用。

目前對于遺傳性耳聾基因診斷所應用的檢測方法主要有Sanger測序法、ARMS-PCR法、熒光PCR法、PCR導流雜交法、DNA微陣列技術、飛行時間質譜法等。