[發明專利]一種定量高通量測序文庫的制備方法及其配套試劑盒

在審

• 申請號: 201710552185.0
• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107217052A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 李鑫輝;王琪;邵志峰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 崔佳佳,馬莉華

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種精確定量制備高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒。

背景技術

隨著高通量測序技術的普及，針對各種不同來源樣品的高通量測序文庫制備方法及商業試劑盒也得到大量應用。市場上主流的高通量文庫制備試劑盒諸如Illumina公司的Truseq系列DNA/RNA文庫制備試劑盒，KAPA公司的Hyper系列建庫試劑盒，NEB公司用于二代測序的NEBNext DNA/RNA文庫制備試劑等，這些種類繁多、功能各異的試劑盒能應對不同測序平臺、不同樣本來源等各種需求，最大程度地滿足科研和臨床等實際應用。不過，目前還沒有一種完全定量化的文庫制備方法，無法滿足精準醫學和定量生物學的實際需要。

因此，本領域尚缺乏一種專門針對精確定量需求的高通量測序文庫制備方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種精確定量化的針對DNA樣品的高通量測序文庫制備方法。

本發明的第一方面提供了一種銜接子，所述銜接子具有式I或II所示的結構：

5'-S1─S2─S3─S4─S5─S6-3' (I)

5'-pS1─S2─S3─S4─S5─S6-3' (II)

各式中，

S1為任選地引導部(N)_m，N為A、T、G、C中任一堿基，m為1-150的正整數；

pS1為磷酸化的S1；

S2為莖部1，具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；

S3為環部，其中含有至少一個堿基U；

S4為莖部2，具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；

S2與S4完全互補或部分互補；

S5為無或與引導部S1互補的延伸部；

S6為無或含有至少一個堿基T的結合部；

若S5為無，則S6為無；

“─”為化學鍵。

在另一優選例中，所述的銜接子為線性結構、或莖環結構。

在另一優選例中，所述的銜接子具有式III或IV所示結構：

在另一優選例中，m為1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整數。

在另一優選例中，m為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

在另一優選例中，所述環部S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述S6含有1個堿基T。

在另一優選例中，所述銜接子的S2具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列；S4具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列。

在另一優選例中，S2與S4是完全互補的，或除了未互補的1或2個堿基之外均為是互補的。

本發明的第二方面提供了一種基于核酸樣品構建測序文庫的方法，包括步驟：

(a)提供一用于構建測序文庫的核酸樣品；

(b)對所述的核酸樣品進行末端修復反應，獲得末端經修復的核酸樣品；

(c)對所述的末端經修復的核酸樣品進行3'末端加dA尾反應，獲得經加尾的核酸樣品；

(d)將所述經加尾的核酸樣品與權利要求1-5中任一所述的銜接子混合，并進行連接反應，從而形成含“銜接子-核酸-銜接子”復合物的第一混合物；

(e)將步驟(d)中獲得的“銜接子-核酸-銜接子”復合物與USER酶混合，使得銜接子中的U被降解，形成含末端分叉不互補的“銜接子-核酸-銜接子”復合物的第二混合物；

(f)將步驟(e)中獲得的含所述復合物的第二混合物與片段分選磁珠混合，使得所述片段分選磁珠吸附多余的銜接子，并將所述被吸附的銜接子去除，獲得第三混合物；

(g)以步驟(f)獲得的所述復合物為模板，用特異性結合于銜接子的第一引物和特異性結合于銜接子的第二引物進行PCR反應，獲得擴增產物；

(h)以將步驟(g)中獲得的擴增產物為原料，制得測序文庫。

在另一優選例中，在步驟(h)中，還包括對所述擴增產物進行純化的步驟。

在另一優選例中，所述的純化包括用片段分選磁珠去除多余的引物。

在另一優選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：