[發明專利]一種定量高通量測序文庫的制備方法及其配套試劑盒

在審

• 申請號: 201710552185.0
• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107217052A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 李鑫輝;王琪;邵志峰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 崔佳佳,馬莉華

1.一種銜接子，其特征在于，所述銜接子具有式I或II所示的結構：

5'-S1─S2─S3─S4─S5─S6-3'(I)

5'-pS1─S2─S3─S4─S5─S6-3' (II)

各式中，

S1為任選地引導部(N)_m，N為A、T、G、C中任一堿基，m為1-150的正整數；

pS1為磷酸化的S1；

S2為莖部1，具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；

S3為環部，其中含有至少一個堿基U；

S4為莖部2，具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；

S2與S4完全互補或部分互補；

S5為無或與引導部S1互補的延伸部；

S6為無或含有至少一個堿基T的結合部；

若S5為無，則S6為無；

“─”為化學鍵。

2.如權利要求1所述的銜接子，其特征在于，m為1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整數。

3.如權利要求1所述的銜接子，其特征在于，所述環部S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列。

4.如權利要求1所述的銜接子，其特征在于，所述S6含有1個堿基T。

5.如權利要求1所述的銜接子，其特征在于，所述銜接子的S2具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列；S4具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列。

6.一種基于核酸樣品構建測序文庫的方法，其特征在于，包括步驟：

(a)提供一用于構建測序文庫的核酸樣品；

(b)對所述的核酸樣品進行末端修復反應，獲得末端經修復的核酸樣品；

(c)對所述的末端經修復的核酸樣品進行3'末端加dA尾反應，獲得經加尾的核酸樣品；

(d)將所述經加尾的核酸樣品與權利要求1-5中任一所述的銜接子混合，并進行連接反應，從而形成含“銜接子-核酸-銜接子”復合物的第一混合物；

(e)將步驟(d)中獲得的“銜接子-核酸-銜接子”復合物與USER酶混合，使得銜接子中的U被降解，形成含末端分叉不互補的“銜接子-核酸-銜接子”復合物的第二混合物；

(f)將步驟(e)中獲得的含所述復合物的第二混合物與片段分選磁珠混合，使得所述片段分選磁珠吸附多余的銜接子，并將所述被吸附的銜接子去除，獲得第三混合物；

(g)以步驟(f)獲得的所述復合物為模板，用特異性結合于銜接子的第一引物和特異性結合于銜接子的第二引物進行PCR反應，獲得擴增產物；

(h)以將步驟(g)中獲得的擴增產物為原料，制得測序文庫。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中核酸樣品總量為500pg～1μg。

8.一種基于核酸樣品構建測序文庫的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

一末端修復/加dA尾復合酶及其緩沖液；

一T4DNA連接酶；

一銜接子，所述的銜接子如權利要求1-5中任一所述；

和說明書，所述的說明書記載了使用方法。

9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：特異性結合于銜接子的第一引物和第二引物。

10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述第二引物帶有測序標記。