[發(fā)明專利]一種利用暗場顯微鏡肉眼直接觀察隱孢子蟲的方法

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• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107271441A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周昕;陳風(fēng)雷
• 申請（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號: G01N21/84
• 分類號: G01N21/84;G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病原體檢測領(lǐng)域，具體涉及一種利用暗場顯微鏡肉眼直接觀察隱孢子蟲的方法。

背景技術(shù)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是全球六大腹瀉病原之一，屬于人畜共患病原體，嚴(yán)重危害人類的公共衛(wèi)生健康。在正常的人群中，感染隱孢子蟲的病人表現(xiàn)為腹瀉，并伴有胃痙攣、惡心、低燒、消化功能障礙等；對免疫力低下的人來說，病癥多變且嚴(yán)重，多為持續(xù)性霍亂樣腹瀉，最終導(dǎo)致患者脫水死亡。隱孢子蟲卵囊在環(huán)境中廣泛存在，可通過水源和環(huán)境中的各種其它因素如動物接觸、公共環(huán)境污染等進(jìn)行傳播造成疾病暴發(fā)。隱孢子蟲被美國列為生物恐怖戰(zhàn)劑中的寄生蟲病原，也是世界多國飲用水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的必檢微生物病原之一。為了保障飲水安全和公共健康，隱孢子蟲防控己經(jīng)成為世界關(guān)注的研究熱點(diǎn)。而檢測隱孢子蟲在環(huán)境中的分布對于隱孢子蟲病防控至關(guān)重要。

目前，現(xiàn)有的檢測隱孢子蟲的方法主要包括：(1)美國環(huán)境保護(hù)署發(fā)布的飲用水中隱孢子蟲卵囊的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法(EPA1623)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是在免疫磁珠分離的過程中去除了環(huán)境樣本中的雜質(zhì)，保證了提取出來的卵囊的純度，靈敏性、準(zhǔn)確性高，并可判斷卵囊活性。但該方法工作量大、操作繁瑣、所需的檢測設(shè)備和耗材也非常昂貴，不適合于基層實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模常規(guī)檢測；(2)改良酸性染色法，其優(yōu)點(diǎn)是步驟少、簡便易行、結(jié)果明顯、不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備、適于實(shí)驗(yàn)室檢測工作，但是該種方法假陽性檢測率高；(3)ELISA法，其優(yōu)點(diǎn)是簡便、快速和敏感，但該方法也存在漏診或誤診現(xiàn)象；(4)PCR檢測，其優(yōu)點(diǎn)是特異性和敏感性，短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增大量的目的片段，但該方法引物的設(shè)計(jì)非常重要，因?yàn)槿绻锾禺愋圆粡?qiáng)，而且對DNA污染敏感，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性也不高，尤其是當(dāng)感染劑量很小的時(shí)候，除此之外，PCR檢測需要具有專業(yè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器，需要專業(yè)的技術(shù)人員，限制了其在基層工作中的使用。

本發(fā)明旨在提供一種利用暗場顯微鏡肉眼直接觀察水中隱孢子蟲的方法。首先將抗體和磁珠進(jìn)行偶聯(lián)，構(gòu)建具有特異性捕獲隱孢子蟲的磁探針。此探針利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，可緊密結(jié)合隱孢子蟲卵囊，該復(fù)合物在磁場的作用下做定向運(yùn)動，從而達(dá)到分離孢子蟲卵囊的作用，在暗場顯微鏡下可形成清晰為肉眼所見的金黃色花冠狀結(jié)構(gòu)。該分離檢測技術(shù)在細(xì)菌、病毒和細(xì)胞的分離檢測等方面應(yīng)用較為廣闊，但是直接利用暗場顯微鏡進(jìn)行觀察還未見報(bào)道。該方法能夠?qū)λ畼印⑷橹破泛图S便中的隱孢子蟲進(jìn)行快速診斷和檢測，縮短檢測周期，簡化檢測過程，提高檢測手段的普遍適用性，利于實(shí)地現(xiàn)場檢測，從而快速、準(zhǔn)確、敏感、簡便地檢測隱孢子蟲的存在，及時(shí)防控，在很大程度上減少隱孢子蟲對人類健康造成威脅。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種利用暗場顯微鏡肉眼直接觀察隱孢子蟲的方法，能夠?qū)λ畼印⑷橹破泛图S便進(jìn)行快速診斷和檢測，縮短檢測周期，簡化檢測過程，提高檢測手段的普遍適用性，利于實(shí)地現(xiàn)場檢測，從而快速、準(zhǔn)確、敏感、簡便地檢測隱孢子蟲的存在，及時(shí)防控，在很大程度上減少隱孢子蟲對人類健康造成威脅。

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的是建立一種利用暗場顯微鏡肉眼直接觀察隱孢子蟲的方法，采用技術(shù)方案以下：

一種利用暗場顯微鏡肉眼直接觀察隱孢子蟲的方法，該方法是將商品化隱孢子蟲卵囊抗體和商品化包被有蛋白A的磁珠進(jìn)行新和偶聯(lián)獲得磁探針，然后利用裝載有針對隱孢子蟲卵囊抗體的磁探針對待測樣品中的隱孢子蟲進(jìn)行捕獲，然后在暗場顯微鏡觀察結(jié)果。

本發(fā)明具體的步驟如下：

(1)磁珠的清洗：將包被有蛋白A的磁珠進(jìn)行清洗，獲得分散性較均一的磁珠；

(2)抗體的偶聯(lián)：將隱孢子蟲卵囊抗體和步驟(1)中清洗后的磁珠混合，進(jìn)行新和偶聯(lián)，獲得具有特異捕獲隱孢子蟲能力的磁探針；

(3)將步驟(2)中磁探針與待測樣本孵育一段時(shí)間，得混合液；

(4)磁分離上述混合液，用PBS重懸混合物后，滴加到載玻片上，暗場顯微鏡觀察。

優(yōu)選地，所述方法，步驟如下：

(1)磁珠的清洗：將包被有蛋白A的磁珠與含有BSA的PBS溶液進(jìn)行混合，磁分離后靜置，棄上清，重懸于含有BSA的PBS溶液中，超聲后磁分離，棄上清，洗滌后重懸于含有BSA的PBS溶液中，獲得分散性較均一的磁珠；

(2)抗體的偶聯(lián)：將商品化隱孢子蟲卵囊抗體和步驟(1)中清洗后的磁珠按照質(zhì)量比為1:1-2:5混合，常溫孵育1-6h；然后磁分離洗滌未結(jié)合抗體，最后用含BSA的PBS溶液洗滌后重懸于PBS溶液中，獲得具有特異捕獲隱孢子蟲的磁探針；