[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用暗場(chǎng)顯微鏡肉眼直接觀察隱孢子蟲(chóng)的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710550768.X
• 申請(qǐng)日: 2017-07-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107271441A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周昕;陳風(fēng)雷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/84
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/84;G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種利用暗場(chǎng)顯微鏡肉眼直接觀察隱孢子蟲(chóng)的方法，其特征在于，將隱孢子蟲(chóng)卵囊抗體和包被有蛋白A的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)，構(gòu)建具有特異性捕獲隱孢子蟲(chóng)的磁探針；用該探針捕獲待測(cè)樣品中的隱孢子蟲(chóng)卵囊，在暗場(chǎng)顯微鏡觀察結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下：

(1)磁珠的清洗：將包被有蛋白A的磁珠進(jìn)行清洗，獲得分散性較均一的磁珠；

(2)抗體的偶聯(lián)：將隱孢子蟲(chóng)卵囊抗體和步驟(1)中清洗后的磁珠混合，進(jìn)行新和偶聯(lián)，獲得具有特異捕獲隱孢子蟲(chóng)能力的磁探針；

(3)將步驟(2)中磁探針與待測(cè)樣本孵育一段時(shí)間，得混合液；

(4)磁分離上述混合液，用PBS重懸混合物后，滴加到載玻片上，暗場(chǎng)顯微鏡觀察。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟如下：

(1)磁珠的清洗：將包被有蛋白A的磁珠與含有BSA的PBS溶液進(jìn)行混合，磁分離后靜置，棄上清，重懸于含有BSA的PBS溶液中，超聲后磁分離，棄上清，洗滌后重懸于含有BSA的PBS溶液中，獲得分散性較均一的磁珠；

(2)抗體的偶聯(lián)：將商品化隱孢子蟲(chóng)卵囊抗體和步驟(1)中清洗后的磁珠按照質(zhì)量比為1:1-2:5混合，常溫孵育1-6h；然后磁分離洗滌未結(jié)合抗體，最后用含BSA的PBS溶液洗滌后重懸于PBS溶液中，獲得具有特異捕獲隱孢子蟲(chóng)的磁探針；

(3)用步驟(2)構(gòu)建好的磁探針對(duì)待測(cè)樣品中的隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行捕獲，所述磁探針添加量為每200μL樣本溶液加入50-100μL磁探針；

(4)取步驟(3)中的10-20μL混合液滴加到載玻片上，暗場(chǎng)顯微鏡觀察。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述磁珠的直徑是微米級(jí)到納米級(jí)的磁顆粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述磁珠清洗所用的BSA的濃度為1％，每次清洗的時(shí)間為5min，清洗次數(shù)為3次。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述抗體和磁珠偶聯(lián)時(shí)間為30-60min。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述樣品，為水樣、乳制品和糞便樣品。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述磁探針捕獲隱孢子蟲(chóng)的時(shí)間為30-60min。