[發明專利]一種法氏囊素脂質體的制備方法

在審

• 申請號: 201710549728.3
• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107137694A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 呂小婷;胡萬榮;徐磊;劉友霖
• 申請（專利權）人: 派生特（福州）生物科技有限公司
• 主分類號: A61K38/01
• 分類號: A61K38/01;A61K39/39;A61K9/127;A61P37/04;C07K1/34;C07K1/14
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種法氏囊素脂質體的制備方法。

背景技術

法氏囊 (Bursa of fabricus，BF) 是禽類獨有的中樞體液免疫器官，相當于哺乳動物的骨髓。BF中存在許多生物活性物質，尤其是一些具有免疫調節作用的小肽，能促進禽類及哺乳動物淋巴細胞的分化發育及免疫器官的成熟，一般將這一類小分子生物活性肽稱為法氏囊素(bursin , BS)。近年來人們對BS的生物學功能及其作用機制進行了廣泛的研究。現已證實，BS大多具有免疫調節功能，如囊素三肽，氨基酸組成順序是Lys-His-Gly-NH2，其中 Lys：His：Gly：NH2為1：0.9：1：0.8，可誘導哺乳動物和禽類B細胞的分化，還能提高人的Daudi B細胞中cAM P、cGM P的濃度，并認為該物質在禽類和哺乳動物均有相似的生物活性。

法氏囊素作為一種最初從禽類法氏囊中提取出的物質并沒有種屬的限制性，在多種動物及疾病的研究中不僅證明了它具有提高機體增重和飼料轉化率等效果，還能增強機體的免疫調節水平，具有良好的免疫學活性。因此，將BS作為免疫增強劑用作各種動物疫苗佐劑、飼料添加劑或輔助治療劑等將會大大提高疫苗效果，增強動物的免疫力，保證動物的健康生長，促進養殖業的發展，提高經濟效益。

在以往的研究過程中，多數直接采用法氏囊粗提物作為研究法氏囊活性肽的材料，由于這種粗提物中含有大量非特異的大分子蛋白質等組織成分，給動物機體注射可能會引起不良反應，甚至發生過敏而死亡，干擾或掩蓋了法氏囊素的作用，得不到一個可靠的實驗結果。此外，從法氏囊中提取的法氏囊素，如果直接投入使用，存在法氏囊素不穩定，操作不便等缺點。因此要想進一步研究法氏囊素的生物學活性及其應用，需要改進生產工藝，建立一套正確的制備方法，既保證其生物學活性又有一定的濃度和純度。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種可以提高法氏囊素穩定性的法氏囊素脂質體的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種法氏囊素脂質體的制備方法，包括以下步驟：

1)將磷脂與膽固醇按照質量比1∶3-5混合均勻，得到脂質混合物；

2）在惰性氣體環境中，將上述脂質混合物溶解于乙醚中，然后加入待包封的法氏囊素水相，得到水-有機溶劑兩相體系，并使體系始終處于惰性氣體環境中；

3） 將上述兩相體系置于水浴式超聲儀中進行超聲反應，直至體系中的混合物變為澄清的單相分散體或有乳光的均勻分散體為止；

4）超聲結束后，將體系中的混合物置于旋轉蒸發儀中，減壓旋轉蒸發除去混合物中的殘留的乙醚；

5）收集上述旋轉蒸發后得到的混合物，離心，收集固相，得到法氏囊素脂質體。

所述步驟1），磷脂與膽固醇的質量比為1∶4。

所述步驟2），法氏囊素水相的濃度為1 mg/mL。

所述步驟3），超聲功率為100-150W，超聲時間為10-60min，超聲溫度為10℃以下。

所述步驟4），旋轉蒸發的轉速為150-250 r/min。

所述步驟4）的旋轉蒸發過程，先維持旋轉蒸發瓶內的壓強為500~700mmHg，旋轉蒸發25-35min除去混合物中的大部分殘留乙醚，然后將旋轉蒸發瓶內壓強降低至400~600mmHg，旋轉蒸發15-20 min除去混合物中痕量的乙醚。

所述步驟5），離心條件為：2~8℃條件下，20000-25000g離心25-35 min。

進一步，所述步驟2），法氏囊素的制備方法如下：

1）取新鮮雞法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干凈后，按法氏囊與注射用水的重量比為1∶1-3混合均勻，然后采用組織搗碎機依次按照轉速16000-17000r/min、18000-19000 r/min、21000 -22000r/min進行搗碎，搗碎后的法氏囊經膠體磨勻漿后得到勻漿液，并于-20℃以下凍存；

2）取出凍存的勻漿液反復凍融4-6次；

3）將凍融結束的勻漿液于2~8℃以下，6000-8000 r/min離心15-25min，取上清液；

4）在上清液中加入終濃度為0.01-0.02%β-丙內酯，于2-8℃下攪拌16-32 h進行滅活；

5）將滅活后的溶液于35-39℃水解2-3 h；

6 ）將水解后的溶液用0.22-0.45μm濾膜進行切向流微濾，收集微濾透過液并采用1-5 kD濾膜進行切向流超濾，收集超濾透過液；