[發(fā)明專利]一種控制太白貝母組織培養(yǎng)內(nèi)生菌污染的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710547593.7
• 申請(qǐng)日: 2017-07-06
• 公開（公告）號(hào): CN107258539B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡平;夏燕莉;周先建;楊玉霞;陳鐵柱;方清茂;郭俊霞;吳萍;李青苗;舒光明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 成都金英專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51218
• 代理人: 袁英

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制太白貝母組織培養(yǎng)內(nèi)生菌污染的方法。本發(fā)明控制方法包括：S1、外植體選擇及預(yù)處理：選擇太白貝母新鮮鱗莖，在洗衣粉溶液中浸泡，擦拭，沖洗，濾紙吸干，備用；S2、外植體消毒處理：預(yù)處理后的外植體浸沒在氯化汞溶液中，攪拌，于超凈工作臺(tái)，漂洗，干燥，備用；S3、小鱗莖誘導(dǎo)分化：將S2處理獲得的外植體鱗片掰開，縱向切成2～4mm寬小塊，接種于添加了青霉素和多菌靈的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；S4、繼代培養(yǎng)：每20天繼代培養(yǎng)一次；S5小鱗莖增殖培養(yǎng)：將S4得到的健康小鱗莖，轉(zhuǎn)移至不添加任何滅菌劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本發(fā)明控制太白貝母組織培養(yǎng)內(nèi)生菌污染的方法，內(nèi)生菌污染控制率可達(dá)到96.5%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制太白貝母組織培養(yǎng)過程中內(nèi)生菌污染的方法。

背景技術(shù)

《中華人民共和國(guó)藥典》收載的川貝母為百合科植物川貝母Fritillariacirrhosa D.Don、暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母Fritillaria przewalskii Maxim.梭砂貝母Fritillaria delavayi Franch.太白貝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布貝母Fritillaria unibracteata Hsiao etK.C.Hsia var wabuensis(Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.C.Chen的干燥鱗莖。是名貴川產(chǎn)道地大宗藥材之一，主要用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等病癥，臨床需求量巨大。

太白貝母作為新增來源列入2010版《中國(guó)藥典》，具有野生資源少、適應(yīng)性強(qiáng)、低海拔也能正常生長(zhǎng)發(fā)育等特性，是川貝母中適宜家種栽培的最佳品種。太白貝母種植業(yè)迎來了新的發(fā)展機(jī)遇。

而現(xiàn)有川貝母產(chǎn)量嚴(yán)重不足，需求量卻逐年增加，存在嚴(yán)重的供求矛盾。其藥材來源中有4種已列入國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物名錄且栽種困難。在其生長(zhǎng)期內(nèi)生物量積累緩慢、植株死亡率高，從而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益低下，農(nóng)民種植積極性不高，這一直是制約川貝種植發(fā)展的瓶頸。

在《中國(guó)中藥雜志》1996年01期中收載了《太白貝母的快速繁殖試驗(yàn)》，文中報(bào)道了太白貝母組織培養(yǎng)快速繁殖試驗(yàn)。研究表明：采用MS+NAA1.0mg/L+6～BA3.0mg/L培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織和再生鱗莖的頻率為93％；愈傷組織和再生鱗莖中含有15種人體必需的常量和微量元素，其中大多數(shù)元素的含量均明顯超過栽培鱗莖。但在現(xiàn)有技術(shù)中通過此方法培育得到的鱗莖在培育過程中感染內(nèi)生菌的幾率非常大，能順利進(jìn)行轉(zhuǎn)代繼續(xù)培養(yǎng)的比例低。因此，對(duì)控制太白貝母組培內(nèi)生菌的污染非常關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種控制太白貝母組織培養(yǎng)內(nèi)生菌的污染率高的控制方法。

本發(fā)明太白貝母組織培養(yǎng)過程中內(nèi)生菌的控制方法，包括如下步驟：

S1、外植體選擇及預(yù)處理：以3～4月挖取的太白貝母新鮮鱗莖為外植體，去掉外層腐爛、褐化的鱗片，切除根系；洗凈鱗莖表面，洗衣粉溶液中浸泡4～6min，擦拭鱗莖表面，流水沖洗0.8～1.2h，再用去離子水沖洗4～6次，濾紙吸干，備用；

S2、外植體消毒處理：將S1處理后的外植體，浸沒在濃度為0.08～0.12％的氯化汞溶液中，攪拌，于超凈工作臺(tái)中，漂洗，干燥，備用；

S3、小鱗莖誘導(dǎo)分化：將S2得到的無菌外植體，用滅過菌的鑷子將其鱗片掰開，再用無菌刀片縱切鱗片得2～4mm寬的條狀小塊，將小塊接種于添加了青霉素和多菌靈的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；

S4、小鱗莖繼代培養(yǎng)：將S3步驟的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的小鱗莖在相同培養(yǎng)基上，每20天繼代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)3次；

S5、小鱗莖增殖培養(yǎng)：將S4得到的生長(zhǎng)旺盛的健康小鱗莖，轉(zhuǎn)移至不添加任何滅菌劑的培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)85～95d。