[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于數(shù)字PCR的蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)定基準(zhǔn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710547153.1
• 申請(qǐng)日: 2017-07-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107267624A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武利慶;董蓮華;高運(yùn)華;王晶;鄭康樂(lè);盛靈慧;金有訓(xùn);米薇;楊彬;王志棟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11241
• 代理人: 盧新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于數(shù)字PCR的蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)定方法。

背景技術(shù)

計(jì)量是實(shí)現(xiàn)單位統(tǒng)一、量值準(zhǔn)確可靠的活動(dòng)，研究建立高準(zhǔn)確度的測(cè)量方法是計(jì)量學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。基準(zhǔn)測(cè)量方法是一種具有最高計(jì)量學(xué)品質(zhì)的測(cè)量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最終不確定度可以用SI單位表述，測(cè)量結(jié)果不依賴(lài)被測(cè)量的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。基準(zhǔn)方法是形成量值源頭的依據(jù)。

隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)已經(jīng)經(jīng)歷了從“描述生物學(xué)”向“實(shí)驗(yàn)生物學(xué)”再向“創(chuàng)造生物學(xué)”發(fā)展的過(guò)程，當(dāng)今的生物學(xué)已經(jīng)成為精準(zhǔn)定量的科學(xué)。沒(méi)有對(duì)生命體各類(lèi)生命現(xiàn)象的精確測(cè)量，便難以對(duì)生命過(guò)程進(jìn)行全方位的調(diào)控與干預(yù)。蛋白質(zhì)作為一類(lèi)重要的生物大分子，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，在體內(nèi)各個(gè)生命活動(dòng)如營(yíng)養(yǎng)代謝、酶催化、激素、免疫、遺傳、變異等過(guò)程中均離不開(kāi)蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮。鑒于蛋白質(zhì)生物體內(nèi)的重要作用，它已經(jīng)成為眾多領(lǐng)域的檢測(cè)靶標(biāo)。例如在體外診斷中，常見(jiàn)的體外診斷項(xiàng)目中有一半以上檢測(cè)對(duì)象為蛋白質(zhì)；在食品安全中，160多種食品含有可以導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的食品過(guò)敏原，其中大于90％的過(guò)敏原都是蛋白質(zhì)，根據(jù)國(guó)內(nèi)食品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)管理規(guī)定，相應(yīng)的蛋白質(zhì)過(guò)敏原均應(yīng)被檢測(cè)并被標(biāo)識(shí)；在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，目前已經(jīng)批準(zhǔn)150多個(gè)蛋白質(zhì)藥物上市，400多種蛋白質(zhì)藥物處于臨床研究階段，3000多種處于臨床前研究階段。不論是體外診斷，還是食品安全與用藥安全，這些都關(guān)乎大眾健康與國(guó)計(jì)民生，相關(guān)領(lǐng)域蛋白質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可比則是保證大眾健康與安全的基石。

通過(guò)建立量值溯源傳遞體系來(lái)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確一致已經(jīng)成為共識(shí)，是計(jì)量界的通行做法并在傳統(tǒng)的物理計(jì)量與化學(xué)計(jì)量領(lǐng)域得到廣泛和成功的應(yīng)用。量值溯源傳遞體系的建立一是要有量值的源頭，二是要有量值傳遞方法，尤其是要有具有較高測(cè)量準(zhǔn)確度的“基標(biāo)準(zhǔn)”方法，才能保證國(guó)家基準(zhǔn)復(fù)現(xiàn)的量值能夠準(zhǔn)確的傳遞到下一級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或工作計(jì)量器具上。高準(zhǔn)確度量值傳遞方法的缺乏將導(dǎo)致即使國(guó)家基準(zhǔn)能夠復(fù)現(xiàn)出量值，也無(wú)法準(zhǔn)確的傳遞下去，從而使得保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可比成為空談。因此，高準(zhǔn)確度的計(jì)量方法研究在計(jì)量及量值溯源傳遞中具有舉足輕重的作用。

蛋白質(zhì)含量是蛋白質(zhì)的基本屬性，它描述了被定義的“蛋白質(zhì)分子”數(shù)量的多少，是蛋白質(zhì)測(cè)量的基本量值，在各類(lèi)蛋白質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目中占到了80％以上。因此，要保證蛋白質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可比，必須研究建立高準(zhǔn)確度的蛋白質(zhì)含量計(jì)量方法，才能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)量值的準(zhǔn)確傳遞，從而達(dá)到檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可比、實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的互通與互認(rèn)、保證貿(mào)易公平、保護(hù)人民大眾健康的目的。

蛋白質(zhì)含量測(cè)量方法按照測(cè)量準(zhǔn)確度可以分為常規(guī)測(cè)量方法和高準(zhǔn)確度的計(jì)量(潛)基準(zhǔn)測(cè)量方法，常用的計(jì)量(潛)基準(zhǔn)方法包括同位素稀釋質(zhì)譜法、質(zhì)量平衡法和定量核磁法。按照測(cè)量原理可以分為滴定法、光譜法、色譜法、質(zhì)譜法、電泳法、波譜法、綜合法等，例如，常用的凱氏定氮、微量凱氏定氮等屬于滴定法；雙縮脲法、Folin-酚法(Lowry法)、考馬斯亮藍(lán)法等屬于比色光譜法。按照測(cè)量過(guò)程中是否需要上一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可以分為蛋白質(zhì)含量絕對(duì)測(cè)量方法和相對(duì)測(cè)量方法兩類(lèi)。蛋白質(zhì)含量絕對(duì)測(cè)量方法在測(cè)量過(guò)程中不需要同樣的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，而相對(duì)測(cè)量方法在測(cè)量過(guò)程中需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或者通過(guò)括弧法或單點(diǎn)法進(jìn)行定量。質(zhì)量平衡法、定量核磁法、凱氏定氮法屬于絕對(duì)測(cè)量方法，而同位素稀釋質(zhì)譜法、液相色譜法、比色法等大多數(shù)蛋白質(zhì)含量測(cè)量方法都屬于相對(duì)測(cè)量方法。

IDMS是應(yīng)用穩(wěn)定同位素進(jìn)行化學(xué)分析的一種方法，在測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，該方法將一定量的同位素標(biāo)記化合物添加到樣品中，這些同位素標(biāo)記化合物可以是同位素標(biāo)記的元素、氨基酸、肽段或蛋白質(zhì)。待同位素與樣品混合均勻后進(jìn)行水解或酶解的操作，再通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)反應(yīng)后非標(biāo)記物和標(biāo)記物的比例，由此對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。由于該方法所采用的內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物具有幾乎相同的物理化學(xué)性質(zhì)，在分離和分析過(guò)程中始終在一起，因此能夠消除掉前處理過(guò)程和分析過(guò)程中的系統(tǒng)誤差。通過(guò)對(duì)非標(biāo)記物和標(biāo)記物比例的精確測(cè)量及所加入稀釋劑的準(zhǔn)確稱(chēng)量，有效地保證了高精度和高準(zhǔn)確度。一旦稀釋劑與樣品反應(yīng)平衡，同位素比值恒定，在保證測(cè)量操作正確的情況下檢測(cè)結(jié)果很難受到影響，具有很高的穩(wěn)定性。而高靈敏度的質(zhì)譜可以提高IDMS的檢測(cè)水平，進(jìn)行微量、痕量以及超痕量的分析。