[發明專利]一種基于數字PCR的蛋白質活性濃度測定基準方法

在審

• 申請號: 201710547153.1
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107267624A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 武利慶;董蓮華;高運華;王晶;鄭康樂;盛靈慧;金有訓;米薇;楊彬;王志棟
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司11241
• 代理人: 盧新

1.一種基于數字PCR的蛋白質活性濃度測定基準方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)準備待測目標蛋白質的抗體，如果是多克隆抗體，準備一種即可；如果是單克隆抗體，需要準備針對不同表位的兩種單克隆抗體；

(2)將獲得的抗體用生物素進行標記；

(3)合成三段單鏈寡聚核苷酸，其中兩段寡聚核苷酸連接后可與第三段形成具有100～200bp的互補序列，可形成雙鏈DNA；

(4)分別將兩段寡聚核苷酸的5’端和3’端用親和素進行標記；

(5)針對寡聚核苷酸形成的雙鏈片段，設計Taqman探針和對應的引物；

(6)利用生物素-親和素之間的放大親和反應，用寡聚核苷酸標記抗體；如果采用的是多克隆抗體，將多克隆抗體分成兩個部分，每個部分分別與一種寡聚核苷酸混合，形成兩種寡聚核苷酸標記的多克隆抗體；如果是單克隆抗體，每種單克隆抗體分別與一種寡聚核苷酸混合，形成兩種寡聚核苷酸標記的單克隆抗體；

(7)將待測目標蛋白用緩沖溶液稀釋至5000分子/μL以下的濃度，在其中加入寡聚核酸標記的兩種抗體、第三條寡聚核酸片段及DNA連接酶，形成抗原-抗體復合物；然后在其中加入擴增緩沖液、4種dNTP混合物、抗原-抗體復合物、Taqman探針及引物、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺，進行數字PCR擴增反應，得到的拷貝數記為濃度c₀；

(8)在(7)的條件下，除了目標蛋白溶液用雙蒸水替代，其它條件與(7)的條件一致，再次進行數字PCR擴增反應，得到的拷貝數記為c₁；

(9)待測目標蛋白的濃度為c₀-c₁，單位為分子數/μL；如果需要，將分子數濃度除以阿伏伽德羅常數后即得到摩爾濃度。

2.根據權利要求1所述的基于數字PCR的蛋白質活性濃度測定基準方法，其特征在于：所述步驟(1)中：所用抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體；所用抗體應當對目標蛋白具有一定的親和性和特異性；當選用的抗體是單克隆抗體時，需要兩種針對兩個不同表位的單克隆抗體，且兩個表位在空間上應當相距一定的距離，不能存在空間位阻；當選用的抗體是多克隆抗體時，只需要一種即可。

3.根據權利要求2所述的基于數字PCR的蛋白質活性濃度測定基準方法，其特征在于：所述步驟(2)中：用生物素標記抗體，可以自行標記，也可以選用商品化的生物素抗體標記試劑盒進行標記。

4.根據權利要求3所述的基于數字PCR的蛋白質活性濃度測定基準方法，其特征在于：所述步驟(3)中：單鏈寡聚核酸可形成200bp以下的雙鏈DNA結構，且該結構不進一步形成復雜的二級結構；也可以選擇商品化的試劑盒作為標記用的寡聚核苷酸標記探針。

5.根據權利要求4所述的基于數字PCR的蛋白質活性濃度測定基準方法，其特征在于：所述步驟(4)中：親和素標記寡聚核苷酸，可以自行標記；也可以選用商品化的試劑盒進行標記。