[發明專利]一種脯氨酸?4?羥化酶及其重組表達宿主菌的應用

在審

• 申請號: 201710546679.8
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107189990A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 石貴陽;朱惠霖;吳志勇;李由然
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12P13/24;C12R1/125
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙)32228
• 代理人: 聶啟新

技術領域

本發明涉及基因工程和微生物技術領域，尤其是涉及一種芽孢桿菌密碼子優化的脯氨酸-4-羥化酶基因表達的酶及其在枯草芽孢桿菌中合成反式-4-羥脯氨酸的應用。

背景技術

反式-4-羥脯氨酸(trans-4-hydroxyproline，HYP)，白色片狀晶體或粉末，分子式C₅H₉NO₃，分子量大小為131.10。HYP是脯氨酸-4-羥化酶羥化游離L-脯氨酸后的產物，其在第四號位碳上帶有羥基，屬于L-脯氨酸的衍生物，且同L-脯氨酸一樣具有不對稱性。HYP一種高附加值的小品種氨基酸，廣泛應用于醫藥、化工、動物飼料和美容業等方面。

在醫藥方面，HYP作為原料可用于合成消炎藥、碳青霉烯類。在化工上，HYP可作為手性原料合成多種聚合物。在動物飼料應用上，添加反式-4-羥脯氨酸可防止因甘氨酸合成不足而導致的營養不良現象。此外，反式-4-羥脯氨酸用于化妝品中，可作為氧化劑調整細胞的氧化還原狀態。目前，國內生產HYP的主要方法是生物提取法，利用動物蛋白來源，如骨膠、豬皮等為原料，經酸、堿水解后提取反式-4-羥脯氨酸。該方法純化步驟長，成本高，且廢棄物污染嚴重而化學合成方法合成成本高，不適合工業生產。隨著微生物資源的開發和生物技術的發展，利用微生物發酵生產反式-4-羥脯氨酸成為了可能。微生物發酵法生產反式-4-羥脯氨酸，主要是通過外源脯氨酸-4-羥化酶基因的引入，在生物體內架構一條HYP合成途徑，進而轉化游離的L-脯氨酸合成反式-4-羥脯氨酸。

脯氨酸-4-羥化酶，是一種能夠將游離的L-脯氨酸羥化成反式-4-羥脯氨酸的特異性酶。目前國內尚未有報道利用重組枯草芽孢桿菌合成反式-4-羥脯氨酸。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明申請人提供了一種脯氨酸-4-羥化酶及其重組表達宿主菌的應用。本發明依據芽孢桿菌密碼子偏好性優化脯氨酸-4-羥化酶基因，并制備含有該基因的重組枯草芽孢桿菌，用于合成反式-4-羥脯氨酸；本發明為利用枯草芽孢桿菌合成反式-4-羥脯氨酸的工業化生產提供了良好的前景。

本發明的技術方案如下：

一種脯氨酸-4-羥化酶，編碼該所述酶的基因序列如SEQ ID No.1所示；所述酶的蛋白質序列如SEQ ID No.2所示。

一種含有所述脯氨酸-4-羥化酶的重組枯草芽孢桿菌，所述菌株的重組方法包括如下步驟：

(1)制備來源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)，經過枯草芽孢桿菌密碼子優化的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h；

(2)將步驟(1)制得的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h連接到含有木糖啟動子的誘導型表達載體pHY-Bs.xyl上，制得含有脯氨酸-4-羥化酶的重組質粒pHY-Bs.xyl-P4H；

(3)將步驟(2)所得的重組質粒轉入枯草芽孢桿菌WB600中，得到重組菌WB600/pHY-Bs.xyl-P4H，即所述重組枯草芽孢桿菌。

一種所述重組枯草芽孢桿菌的應用，該重組枯草芽孢桿菌可用于合成反式-4-羥脯氨酸。

一種含有所述脯氨酸-4-羥化酶的經遺傳改造的重組枯草芽孢桿菌，所述菌株的構建方法如下：

(1)敲除原始菌株WB600的谷氨酰胺合成酶基因glnA；且過表達谷氨酸激酶基因proB，構建了重組菌WB601；

(2)制備來源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)，經過枯草芽孢桿菌密碼子優化的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h；

(3)將步驟(2)制得的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h連接到含有木糖啟動子的誘導型表達載體pHY-Bs.xyl上，制得含有脯氨酸-4-羥化酶的重組質粒pHY-Bs.xyl-P4H；

(4)將步驟(3)制得的重組質粒pHY-Bs.xyl-P4H轉入WB601中，得到重組菌WB601/pHY-Bs.xyl-P4H，即所述經遺傳改造的重組枯草芽孢桿菌。

一種所述經遺傳改造的重組枯草芽孢桿菌的應用，該重組枯草芽孢桿菌可用于合成反式-4-羥脯氨酸。

本發明有益的技術效果在于：

本發明依據芽孢桿菌密碼子偏好性，對脯氨酸-4-羥化酶基因密碼子進行了相關優化；通過理性改造脯氨酸代謝途徑，提升了重組菌反式-4-羥脯氨酸的合成能力。